植物离体器官发生(in vitro organogenesis)是指植物的离体组织或细胞团(愈伤组织)分化形成离体苗、根或花芽等器官的过程。其理论基础是植物细胞具有全能性,已经分化的细胞能够重新获得干细胞的分化潜能,并经过分化形成新的组织和器官到再生植株。植物离体苗再生是离体器官发生的一种方式,其可进一步发育成完整植株。DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰形式。目前,DNA甲基化研究多集中在总基因组DNA甲基化水平与植物生长发育关系上,有关特定基因甲基化而影响基因表达,进而影响植物生长、发育及体外离体苗再生的研究还鲜有报道。本研究利用拟南芥离体培养体系,拟开展基因启动子DNA甲基化在离体苗再生中的作用研究,为进一步揭示拟南芥细胞全能性的分子机理奠定基础。主要进行了以下研究：1)受DNA甲基化调控且参与离体苗再生的目标基因发掘(包括：参与离体苗再生的候选基因筛选、候选基因启动子DNA甲基化位点、水平、模式及其与基因表达水平关系分析；候选基因组蛋白甲基化及乙酰化状态及其与甲基化关系分析)；2)候选基因DNA甲基化在调控离体苗再生中的作用及其分子机制研究(包括：候选基因突变体离体苗再生能力鉴定、SRF去甲基化对离体苗再生的影响；SRF调控的离体苗再生相关靶基因的发掘及其相互作用关系验证),为进一步阐明目标基因的DNA甲基化在离体苗再生中的作用机制奠定基础。另一方面,利用大豆在盐及非盐胁迫下的基因表达谱,发掘了发生DNA甲基化的盐诱导转录因子基因,并分析了它们在不同盐胁迫处理下的表达水平、DNA甲基化及组蛋白修饰的动态变化及其相互关系。主要的研究过程和实验结果如下：1.启动子DNA甲基化在调控拟南芥离体苗再生中的作用研究1.1受DNA甲基化调控且参与离体苗再生的候选基因发掘1.1.1参与离体苗再生的候选基因筛选胚性愈伤组织(RC)与非胚性愈伤组织(NRC)的获得：RC为黄绿色,含瘤状突起和离体苗,具有高频率的离体苗再生能力；NRC为浅绿色、粉粒状,无离体苗再生能力。参与离体苗再生的候选基因的筛选：1)RC与NRC的基因表达谱分析表明：1432个基因在RC中上调表达,1211个基因在NRC中上调表达。2)利用qRT-PCR验证了芯片结果的可靠性。3)根据基因功能注释,筛选出238个可能参与离体苗再生的候选基因。1.1.2发生启动子DNA甲基化的候选基因筛选Methprimer软件分析表明：在上述238候选基因中,28个基因启动子存在密集的CG岛,推测它们可能发生DNA甲基化。对它们在DNA甲基转移酶基因敲除系(met1、cmt3、drm2和ddm1)及Col-0培养物中的表达分析发现,20个基因在1或2个DNA甲基转移酶基因敲除系培养物中表达上调,推测其表达可能受DNA甲基化调控。1.1.3候选基因启动子在RC及NRC中DNA甲基化状态分析1)候选基因启动子DNA甲基化位点及水平分析：BSP (Bisulfite sequencing PCR)分析发现,在20个候选基因中,6个基因(SRF, MAX3、TFL1、ACC1、 At2g05520和At5g55450)启动子发生了不同位点的甲基化修饰。它们的DNA甲基化水平在RC和NRC中存在明显的差异,SRF在NRC中DNA甲基化水平低,而其它基因在RC中甲基化水平低。2)候选基因的DNA甲基化模式分析：上述6个基因的DNA甲基化修饰既有对称的CG和CNG类型,又有非对称性的CHH类型。SRF启动子甲基化主要发生在CG位点,CNG及CHH位点几乎未发生甲基化。其它基因启动子甲基化在CG、CNG、CHH位点均有发生。1.1.4候选基因DNA甲基化与表达的关系分析上述基因中,SRF, ACC1、MAX3、TFL1和At2g055520的甲基化水平与其表达水平存在明显的负相关性。SRF在RC中发生超甲基化,表达下调；相反,ACC1、 MAX3、TFL1和At2g055520在NRC中发生超甲基化,表达下调。1.1.5候选基因在甲基转移酶基因敲除系培养物中的表达及甲基化状态分析对上述基因启动子在不同DNA甲基转移酶基因敲除系培养物中的甲基化状态及其表达水平分析发现,与Col-0培养物相比,SRF和TFL1在met1、ddm1培养物中发生去甲基化、表达上调；At2g055520在cmt3培养物中去甲基化、表达上调;ACC1、MAX3和At5g55450甲基化水平均未改变,但ACC1、MAX3在met1、cmt3和ddm1表达水平上调；At5g55450表达仅在drm2中上调。表明,SRF和TFL1表达受MET1和DDM1的调控,At2g055520表达仅受CMT3调控。1.1.6候选基因的组蛋白修饰及其与甲基化的关系分析ChIP分析表明,SRF在RC中发生高水平的H3K9me2和低水平的H3K9ac修饰；而ACC1、TFL1、MAX3在NRC中发生高水平的H3K9me2和低水平的H3K9ac修饰。推测上述基因除发生DNA甲基化外,亦可能发生组蛋白H3K9甲基化及乙酰化修饰。1.2启动子DNA甲基化在离体苗再生中的作用及其分子机制研究1.2.1候选基因突变体离体苗再生能力鉴定对SRF去甲基化(上调表达)突变体(srf-1、srf-2)及ACC1、MAX3、TFL1和At2g055520功能缺失突变体的离体苗再生能力分析表明,srf-1、srf-2的离体苗再生能力明显低于Col-0,而acc1-1、max3-9、tfl1-1和At2g055520敲除系的离体苗再生能力与Col-0相近,表明SRF的去甲基化降低了离体苗再生能力。1.2.2SRF调控离体苗再生能力的可能机制1.2.2.1SRF调控的相关候选基因筛选1) RT-PCR及qRT-PCR分析发现,WOX9、WOX8、WOX2、WUS及PIN1在srf-1和srf-2培养物中表达水平明显低于Col-0。2)对WOX9::GUS、srf-2X WOX9::GUS, WUS::GUS、srf-2X WUS::GUS转基因植株培养物的GUS染色分析发现,在srf-2培养物中,WOX9和WUS的表达水平明显低于野生型。表明,SRF可能通过抑制WOX9和WUS表达来降低srf-2的离体苗再生能力。1.2.2.2与SRF直接结合的下游目标基因的筛选1) ChIP分析表明,SRF与WOX9启动子结合,而不与WOX8、WOX2、WUS及PIN1启动子结合,表明,SRF可能通过直接结合WOX9启动子来抑制其转录。2) ChIP-sequencing分析表明,约20个基因片段表现出高水平的测序丰度,推测SRF可能与它们直接结合。1.2.2.3WOX9敲除系wox-1/2抑制离体苗再生对wox9-1和wox9-2离体苗再生能力分析发现,在LSIM(离体苗再生的液体培养体系)中,wox9-1和wox9-2的离体苗再生能力明显低于野生型Col-0。1.2.2.4非胚性愈伤组织(NRC)再生能力的部分恢复1)将RNAi载体pK7GWIWG-SRF转入非胚性愈伤组织(NRC)中,经Kan筛选及分化培养发现,转基因NRC结构变致密,表而长出绿色的苗状突起,非转基因NRC保持原来的松散状态,未形成突起结构,表明转基因NRC离体苗再生能力获得了部分恢复。2) RT-PCR分析发现,WOX9、WOX8、WOX2、WUS及PIN1表达在转基因NRC中明显高于非转基因NRC,表明其上调表达可能促进了NRC再生能力的恢复。2.大豆盐诱导转录因子基因在NaCl处理过程中的DNA甲基化及组蛋白修饰的动态变化2.1盐诱导转录因子基因的筛选及验证1)对大豆在盐及非盐胁迫下的基因表达谱分析发现,49个(15个GmMYBs、9个GmNACs、16个GmAP2/DREBs和9个Gmb-ZIPs)基因在盐胁迫下表达明显上调,表明它们表达受盐胁迫诱导。2)对上述基因在NaCl处理不同时间大豆中的表达水平进行了qRT-PCR验证,结果表明,45个基因(14个GmMYBs、8个GmNACs、8个Gmb-ZIPs和15个GmAP2/DREBs)表达上调。2.2发生DNA甲基化的候选基因的筛选对上述盐诱导基因在DNA甲基转移酶抑制剂5-ADC处理的大豆中的表达分析发现,10个候选基因表达在5-ADC处理下明显上调,推测它们的表达可能受DNA甲基化的调控。2.3候选基因在NaCl处理不同时间大豆中的甲基化状态分析1)对候选基因的甲基化状态分析发现,4个基因(Glmallg02400、 Glma16g27950、Glma20g30840、Glma08g41450)启动子在NaCl处理的大豆中均发生了DNA甲基化,它们的甲基化位点和模式呈现出动态的变化。2)利用Southern-blot分析了上述候选基因在盐胁迫过程中的甲基化状态,发现它们的甲基化位点、水平及模式变化与BSP结果基本一致。3)基因表达水平与甲基化水平相关性分析表明,随着NaCl处理时间的延长,Glma11g02400、Glma16g27950和Glma20g30840的转录水平与甲基化水平存在明显的负相关性,而Glma08g41450表达水平与甲基化水平无关。2.4候选基因在甲基转移酶抑制剂(5-ADC)处理大豆中的甲基化状态分析1)对上述候选基因在甲基转移酶抑制剂(5-ADC)处理不同时间的大豆中的甲基化状态分析发现,Glyma11g02400、Glyma16g27950、Glyma20g30840和Glyma08g41450启动子在对照中均发生DNA超甲基化,在5-ADC处理48h后,启动子的甲基化水平逐渐降低。2)利用Southern-blot对上述基因在5-ADC处理过程中的甲基化状态进行分析,发现它们的甲基化状态变化与BSP结果基本一致。2.5候选基因子在NaCl处理不同时间大豆中的组蛋白修饰状态分析ChIP分析发现,上述候选基因的H3K9me2、H3K9ac和H3K4me3修饰水平在对照和NaCl处理1h、3h、6h、12h和24h中存在明显的差异。在NaCl处理过程中,Glyma11g02400、Glyma20g30840和Glyma08g41450的H3K9me2修饰水平明显降低。Glyma20g30840和Glyma08g41450的H3K9ac修饰水平在NaCl处理6h后明显升高。Glyma11g02400(NaCl处理1h后)、Glyma20g30840(处理3h后)和Glyma08g41450(处理6h后)的H3K4me3修饰水平明显升高。