酿酒酵母中脂肪酸延伸酶Elo2抵御盐胁迫的生理机制

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工业发酵过程中,生产菌株会遭遇到众多胁迫,导致微生物生理功能受损,从而降低菌株的生产性能。本论文为了加强微生物对盐胁迫的抵御能力,以酿酒酵母BY4741为出发菌株,采用适应性进化的策略来提高酵母抵御盐胁迫能力,利用转录组数据解析适应性进化菌株抵御盐胁迫的机制,并利用液质联用和流式细胞仪等分析方法,对Elo2抵御盐胁迫的生理机制展开研究,主要结果如下:1.利用适应性进化技术筛选抵御盐胁迫菌株,并利用转录组数据解析关键盐胁迫抵御路径。采用适应性进化筛选抵御盐胁迫菌株XCG001,半抑制浓度和生长曲线实验发现:在1.5 M NaCl条件下,与出发菌株wt相比,菌株XCG001的细胞浓度提高了37.3%;对NaCl的半抑制浓度提高了55.5%。进一步利用转录组数据分析发现:在菌株XCG001中,糖酵解/糖异生、丙酮酸代谢、脂质代谢、信号转导、果糖和甘露糖代谢路径上调,核糖体与氨基酸代谢路径下调;在1.5 M NaCl条件下,嘧啶代谢和脂质代谢路径上调,丙酮酸代谢和转运路径下调。2.发现过表达Elo2能抵御盐胁迫,并测定其抵御盐胁迫能力。对上调最显著的基因进行过表达,发现Elo2高表达菌株(XCG010)对盐胁迫抵御增强。利用两种强度启动子对Elo2过表达,构建中表达菌株(XCG017)、低表达菌株(XCG016),并进行生长能力和存活率测定发现:在1.0 M NaCl条件下,与对照菌株相比,菌株XCG010、XCG017和XCG016生长情况都明显增强;对NaCl的半抑制浓度都提高了33.3%;细胞浓度分别提高了21.9%、20.8%和19.1%;存活率分别提高了22.1%、20.8%和18.0%。3.解析Elo2抵御盐胁迫的机制。过表达Elo2重组了细胞膜鞘脂组分:在1.0 M NaCl下,与对照菌株相比,发现:Elo2高菌株XCG010中,C20:0、C22:0和C24:0的脂肪酸相对含量分别提高了33.1%、106.4%和31.5%;磷脂酰乙醇胺(PE)和磷脂酰丝氨酸(PS)的相对含量分别增加了18.9%和15.0%;肌醇磷酸神经酰胺(IPC,t18:0/26:0)、甘露糖基肌醇磷酸神经酰胺(MIPC,t18:0/22:0(2OH))、MIPC(d18:0/22:0)、MIPC(d20:0/24:0)、甘露糖基二肌醇磷酸神经酰胺(M(IP)2C,d20:0/26:0(2OH))、M(IP)2C(t18:0/26:0(2OH))和M(IP)2C(d20:0/26:0(2OH))的相对含量分别提高了8833.4%、16689.4%、6329.2%、2391.1%、2792.8%、11376.4%和20806.3%。然后,验证了Elo2是通过增强鞘脂合成抵御盐胁迫。RT-PCR检测发现:菌株XCG010中合成鞘脂路径的转录水平提高;阻断鞘脂路径,即敲除Elo2高菌株XCG010中的神经酰胺合成酶编码基因LAC1,构建突变体XCG018,并进行生长能力和存活率测定,发现:在1.0 M NaCl条件下,与照菌株XCG002相比,突变体XCG018生长增强;存活率提高了10.2%。过表达Elo2改变了细胞膜功能:在1.0 M NaCl条件下,与照菌株XCG002相比,Elo2高菌株XCG010和突变体XCG018细胞膜完整性分别提高了24.4%和11.2%。
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