番茄HSP108.6、HSP60α/β亚基的基因克隆及表达分析

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目前所知,所有的植物、动物、细菌等微生物在超过最适生长温度时都会产生一系列蛋白(热休克蛋白)。这些蛋白具有分子伴侣的功能,防止失活蛋白聚集成团,辅助新生多肽链正确折叠,或者帮助溶解聚集失活的蛋白。热激蛋白可以分为几个家族:HSP100,HSP90,HSP70,HSP60,HSP40,sHSP。在细菌、酵母和植物体内ClpB 蛋白可以依靠ATP 溶解热激反应中细胞质和细胞核内形成的蛋白聚集物。Cpn60(HSP60)叶绿体cpn60 主要功能包括:叶绿体蛋白的穿膜运输,叶绿体分化和果实成熟。本实验从利用EST 方法对热激制备的番茄cDNA 文库进行了超长基因克隆的筛选,获得了五个基因全序:chaperonin-60 alpha subunit;chaperonin-60 beta subunit;ClpB heat shock protein ;TPR-repeat protein ; heat shock protein 83;peptidylprolylisomerase.。选取HSP108.6 和chaperonin-60 beta subunit,研究了它们的生化特性。叶绿体HSP108.6 基因全长3144bp,共编码984 个氨基酸。通过对ClpB 的序列特征及同源性的分析表明,它与利马豆的叶绿体ClpB 及拟南芥HSP109 序列高度相似,具有一个预测的叶绿体信号肽。以GST-HSP108.6-融合蛋白为抗原免疫家兔,制备了HSP108.6 抗体,首次在分子水平上证明了这个基因的叶绿体定位。Southern 杂交显示,叶绿体HSP108.6 在番茄基因组中有两个以上的拷贝。Northern杂交显示,HSP108.6 在番茄叶片中是诱导型表达的,32℃时即出现表达,而且表达量随温度升高而增加。Western 结果与Northern 结果一致。果实蛋白Western 分析表明,在番茄果实中是HSP108.6 组成型表达的,随温度升高表达量增加。番茄叶绿体HSP60α亚基序列cDNA 片段全长2117bp,共编码579 个氨基酸。叶绿体HSP60 β亚基cDNA 片段全长2207bp,编码509 个氨基酸。以GST-HSP 60β亚基融合蛋白为抗原免疫家兔,制备了HSP60β亚基的特异性抗体。通过Western 比较了叶绿体HSP60β亚基、HSP108.6 和sHSP 的表达差异:HSP60 是组成型表达;HSP108.6 在常温下不表达,32℃时开始出现,38℃达到最高峰,40℃、42℃略有下降,说明该基因的表达受热诱导;sHSP 在常温下不表达,36℃出现表达。因此热激蛋白存在多种表达模式。
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