前额叶皮层过表达Kv1.1对脆性X综合征大脑兴奋性调控的治疗探讨

来源 :广州医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:qianchuanzhishui
下载到本地 , 更方便阅读
声明 : 本文档内容版权归属内容提供方 , 如果您对本文有版权争议 , 可与客服联系进行内容授权或下架
论文部分内容阅读
【目的】脆性X综合征(Fragile X syndrome,FXS)是一种以智能发育迟滞、过度活动、自闭症和伴发癫痫等常见神经精神症状为表现的遗传性疾病。电压依赖型钾通道(Kv1.1)由Kcna1基因负责编码,属于电压门控钾通道的Shaker子家族,可调控中枢及外周神经系统神经元的兴奋性。Kv1.1的功能改变可引起神经系统兴奋性紊乱,导致例如1型发作性共济失调(EA1)、癫痫等疾病发生。我们课题组前期研究发现脆性X综合征模型小鼠(Fmr1敲除鼠,Fmr1 KO鼠)大脑皮层神经元电活动亢进,动作电位发放数量增多,与电压依赖型钾通道(Kv1.1)的表达下调与功能改变相关。Kv1.1被认为是神经系统电兴奋性的重要调控因子。目前有大量数据证实腺相关病毒(Adeno-associated virus,AAV)介导基因转导的有效性及安全性。因此,我们以AAV为载体携带Kcna1基因在小鼠前额叶皮层注射,使得Kv1.1在前额叶皮层过表达,从而探讨前额叶皮层过表达Kv1.1如何参与神经元的兴奋性调控,以及在脆性X综合征疾病过程中的潜在治疗作用。【方法】1.PCR扩增法鉴定FXS模型小鼠及FVB野生(WT)鼠基因型。2.构建表达目的片段小鼠Kcna1基因的质粒。小鼠Kcna1基因在C端用V5标记,并插入p AAV中,该p AAV采用EGFP报告基因标记的人突触蛋白1基因启动子。无Kcna1基因和V5标签目标基因插入的p AAV被用做对照组。分别命名为p AAV-Kcna1-EGFP,p AAV-EGFP。3.实验分组:随机选取新生WT和KO同窝小鼠。对照组:包括WT-sham组和KO-sham组,分别对WT和KO小鼠给予p AAV-EGFP双侧前额叶立体定位注射。实验组(KO-Kcna1组):给予KO同窝小鼠p AAV-Kcna1-EGFP双侧前额叶立体定位注射。4.在注射后14天病毒表达高峰期,制作急性脑片,利用全细胞膜片钳技术,对3组小鼠的PFC感染的神经元进行电生理记录,探讨过表达Kv1.1对神经元动作电位发放以及钾电流的改变。5.待小鼠发育成熟后进行Y-迷宫自发交替实验、旷场实验、Morris水迷宫实验、戊四唑(PTZ)诱导癫痫易感性等行为学实验。6.提取各组小鼠前额叶皮层脑组织行Western Blot方法检测Kv1.1表达情况,以及Kv1.1翻译调控因子,包括m TOR,磷酸化m TOR(位点S2448),Hu D,PERK,磷酸化PERK(位点Thr980)的表达改变。7.统计学分析:数据采用均数±标准误表示,癫痫发作发生率采用卡方检验。其它均采用单因素方差分析,两两比较采用Bonferroni检验。P<0.05,统计学有显著性差异。【结果】1.我们利用旷场实验以及Y迷宫自发交替实验分析实验动物在新异环境的空间探索行为以及焦虑行为。在旷场实验中,我们发现与两对照组相比,KO-Kcna1组在中心区域停留时间延长(与KO-sham组比较,P=0.030;与WT-sham组比P=0.003)。中央区域时间的增加通常被认为焦虑样行为减少。在旷场实验中,其它行为学指标如行走总距离、中心区行走总距离、穿过中心区次数、休息时间、奔跑速度组间未见显著差异。在Y迷宫自发交替试验中,三组小鼠间未见显著差异。2.Morris水迷宫被用于观察空间记忆和学习能力。在前4天的训练期,随着训练次数的增加,三组小鼠均表现寻找平台时间缩短。在第5天测试中,可见WT-sham组在目标象限游泳路径总长度较其它象限明显增长(P<0.05),而KO小鼠(包括KO-sham和KO-Kcna1组)无显著差异。此外,我们发现KO小鼠(包括KO-sham,和KO-Kcna1组)的游泳速度均较WT-sham组显著增快(P<0.05)。其它如逃避潜伏期、穿过平台数组间未见明显差异。KO-Kcna1组与KO-sham组间无明显差异。结果提示KO小鼠表现空间记忆和学习能力下降,过表达Kv1.1无改善作用。3.PTZ诱导癫痫的易感性评价试验结果显示KO-sham组全面性强直阵孪发作(GTCS)的发生率(13/18)较WT-sham组显著增高(9/24)(P=0.026),而KO-Kcna1组(6/18)出现显著下降。进行癫痫评分发现与KO-sham组相比,KO-Kcna1组及WT-sham组在各时间点出现癫痫评分及各时间点发作总评分较低(P<0.05)。而诱导癫痫潜伏期未见明显差异。结果提示脆性小鼠的癫痫易感性较高,而过表达Kv1.1可降低癫痫发作级别。4.我们利用膜片钳技术记录三组小鼠AAV感染的前额叶皮层第IV层锥体神经元。结果显示与WT-sham组相比,KO-sham组的神经元动作电位(AP)发放数、最大放电频率(maximal spiking frequency,MSF)增多,差异具有统计学意义(P<0.05);KO-Kcna1组神经元动作电位(AP)发放数较KO-sham显著减少(P<0.05)。KO-Kcna1组神经元MSF较KO-sham有部分减少,较WT-sham组相比无明显差异。5.采用电压钳技术记录钾电流,结果发现KO-sham组介导总钾电流峰值较WT-sham组明显下降(P<0.05),而KO-Kcna1组较KO-sham组显著升高(P<0.05),较WT-sham组有一定程度增高,但差异无统计学意义。我们进一步用Kv1.1选择性阻断剂DTX-κ完全阻断Kv1.1通道,分离Kv1.1介导的钾电流(IKv1.1),结果显示,KO-sham组IKv1.1较WT-sham组明显下降,而KO-Kcna1组较KO-sham组明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。6.KO-sham组神经元电压依赖激活曲线相对WT-sham组右移,半数激活电压显著增高(P<0.05)。KO-Kcna1治疗组半数激活电压较KO-sham组下降,但与WT-sham组比较仍有一定程度增高(P<0.05)。三组间的半数失活电压无明显差异。KO-Kcna1组失活曲线的斜率较其他两组明显升高(P<0.05)。这些结果提示过表达Kv1.1可显著增加神经元Kv1.1特异性电流,改变电流的电压依赖属性,减少动作电位的发放。7.Western bolt显示三组间的Kv1.1、m TOR、p-m TOR蛋白表达水平呈平行关系,表现为KO-sham组最低,而KO-Kcna1治疗组最高。Hu D、PERK及p-PERK蛋白表达水平三组间未见明显差异。比较m TOR和PERK的磷酸化水平发现,KO-sham组较WT-sham组的m TOR磷酸化程度明显降低,而治疗组可使m TOR磷酸化恢复至WT-sham组的水平(P<0.05)。PERK磷酸化改变与m TOR正相反,KO-sham组显著增高(P<0.05),治疗组也恢复至野生型对照组的水平。结果提示m TOR和PERK激活与Kv1.1的蛋白水平密切相关。【结论】1.脆性X综合症模型小鼠PFC过表达Kv1.1产生抗焦虑效果,使焦虑样行为减少;癫痫易感性降低,但对学习记忆无显著改善。2.脆性X综合症模型小鼠神经元Kv1.1蛋白表达不足。通过AAV介导的外源性Kv1.1表达可恢复细胞Kv1.1表达量和部分功能,表现为Kv1.1特异性电流、总钾电流增大,抑制动作电位的发放,降低神经元兴奋性。3.细胞内Kv1.1的蛋白水平与m TOR蛋白表达、m TOR及PERK的磷酸化激活水平密切相关。m TOR和PERK途径可能是脆性X综合征模型小鼠Kv1.1表达异常的上游机制。4.Kv1.1是神经元的重要兴奋性调控因子。Kv1.1的表达不足在脆性X综合征的病理生理过程中扮演重要角色。通过基因治疗的手段改变Kv1.1的表达可调节神经兴奋性,提示对兴奋性失调的疾病(如FXS)具有潜在的治疗意义。
其他文献
研究背景:婴幼儿血管瘤是一种常见的婴幼儿良性脉管肿瘤,其发病率在4%至5%之间,是一种自限性疾病。瘤体在增生期生长快速,如果不进行干预,可能导致破溃、感染等并发症,严重时
青少年身心健康发展一直是我们国家高度关注的焦点。在新一轮体育课程改革的背景下,基于校园足球热的兴起、学校“一校一球一操”政策的推广,本研究采用文献资料法、问卷调查
HTTP洪泛攻击是一种针对Web应用的拒绝服务攻击。攻击者通过模拟正常用户报文,利用HTTP协议产生的海量数据作为掩护,大大增加了对应用层洪泛攻击的检测难度。基于网络流量的检测,能有效检测洪泛攻击的存在,采用熵等统计学方法和基于机器学习的检测算法已经有了成功的应用。然而,主流检测方法中存在着未考虑较为完整的特征集评估过程、检测模型大都为浅层学习且较少考虑时间序列信息、检测结果缺少解释性的问题。本文
产学研合作是国家创新系统的重要组成部分,对科技发展具有举足轻重的作用。随着中美经贸斗争向高科技产业延伸,我国在核心技术“卡脖子”的问题日益凸显。加强产学研合作,提高自主创新能力,显得尤为迫切。从知识共享的角度来看,产学研合作是一种实现专业知识资源的优化配置的模式。各方主体以专业知识共享的方式,实现知识传递、转化和反馈,充分发挥知识的溢出效应,实现各方主体的知识增值。进入大科技时代以来,科学技术随着
芦根为多年生禾本科植物芦苇干燥或者新鲜的根茎,我国许多地方都有分布,作为常用的中草药,其具有清热、除烦、生津、利尿和止呕的作用。现代药理研究表明:芦根具有对肝的纤维
约翰·阿什贝利(John Ashbery)是一位先锋派诗人,在当代美国诗坛颇具影响。他一生出版20多部诗集,赢得了美国几乎所有诗歌奖项。时空一直是他诗歌所探讨的主题之一。本论文借助于巴赫金的时空体理论,探讨阿什贝利在他的诗集《春天的双重梦幻》,《船屋的日子》,《这是你的名字》,《中国私语》,“凸面镜中的自画像”呈现城市、田园、凸面镜中的自画像时空的不同方式。时空体理论由巴赫金在《对话性想象》中提出
中国共产党自成立之日起就把为中国人民谋幸福、为中华民族谋复兴写在自己的旗帜上,在革命战争年代即使在短暂的局部执政时期也坚持人民至上、不断创造条件改善人民群众的生
互联网随着近几年信息技术的高速发展,已深入到各行各业当中,在这样的大环境下,微课随着“互联网+”理念的提出逐渐成为教育领域的热门产物。微课对于解决小学阶段的学生注意力不集中,活泼好动而且好奇心强,在体育课堂中很难集中注意力,导致学习效率不高这些问题有一定的作用。微课可以简化小学篮球教学中比较复杂的动作,对技术要求多的教学内容进行分解,可以让认知能力有限的小学生学起来更加轻松,更容易激发他们对学习篮
党的十九届四中全会强调"坚持和完善党和国家监督体系",要求健全党统一领导、全面覆盖、权威高效的监督体系,增强监督严肃性、协同性、有效性。纪检监察机关作为党内监督和国
自建筑出现以来,人类就不断追求使其跨越更大空间的可能性,大跨度建筑及大跨度结构技术是一个国家建筑科技水平的重要标志之一。本文以大跨度结构的工程问题为导向,以为结构