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研究背景与目的食管鳞癌（Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）是消化系统常见的恶性肿瘤之一,发病率和死亡率高。目前,食管癌的治疗手段仍是以手术为主的综合治疗,但患者术后5年生存率仍停留在15-25%,复发转移是导致患者死亡的主要原因。研究发现,食管鳞癌组织中存在少数OCT4（Octamer-binding transcription factor4,OCT4）阳性的癌细胞,该类患者肿瘤进展迅速,容易发生淋巴结转移,患者无瘤生存期和总生存期缩短。OCT4是POU家族关键转录因子之一,在维持调节胚胎干细胞自我更新及多向分化过程中起重要作用。最近研究证实OCT4在实体肿瘤如食管鳞癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、肝癌和头颈部肿瘤中高表达,并且与肿瘤的克隆性增殖、复发转移以及患者不良预后密切相关。OCT4在实体肿瘤中的表达不仅为肿瘤干细胞理论提供了理论依据,而且也成为恶性肿瘤生物治疗的潜在靶点。食管鳞癌的转移途径以淋巴结转移为主,这也是患者治疗效果差、5年生存率低的最主要原因。近年,有关上皮间质转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）在上皮组织起源恶性肿瘤中的作用已成为研究热点,越来越多的证据表明EMT在食管鳞癌发生发展的过程中扮演了重要角色。EMT是上皮来源的细胞转化为具有间质表型细胞的生物学过程,这个过程在肿瘤发生发展中起关键性作用,EMT不仅赋予癌细胞更强的侵袭迁移活性和抵抗失巢凋亡能力,还可促使癌细胞维持干细胞特性,促进肿瘤干细胞的自我更新。因此,EMT是上皮来源性肿瘤发生侵袭转移的重要途径。研究发现,具有干细胞特征的癌细胞特别是OCT4阳性的癌细胞,更容易发生EMT,促进肿瘤快速复发转移。VEGF-C是血管内皮生长因子家族成员之一,VEGF-A/B/D/F主要促进血管内皮的形成,而VEGF-C是该家族比较特殊的一员,其主要功能是通过激活一系列生物信号通路,促进淋巴管内皮细胞增殖、分化,进而形成淋巴管。研究表明VEGF-C与胃癌、乳腺癌、大肠癌等恶性肿瘤的转移密切相关,并有研究报道VEGF-C可诱导肿瘤细胞发生EMT促进肿瘤细胞侵袭转移。既往研究证实,OCT4与VEGF-C不同程度参与恶性肿瘤的发生发展,均能诱导癌细胞发生EMT,促进肿瘤细胞发生转移,但二者在食管鳞癌发生发展过程中的相互作用,国内外文献均未见报道。探讨二者之间相互调控的机制,对深入了解食管鳞癌的发病机理,寻求特异、高效的生物治疗靶点,遏制食管鳞癌淋巴结转移至关重要。本课题以OCT4诱导食管鳞癌细胞发生EMT并促进癌细胞转移为切入点,开展了以下研究:第一部分OCT4与VEGF-C高表达对食管鳞癌患者预后的影响实验材料和方法:收集67例食管鳞癌标本及癌旁正常组织,采用免疫组化、Western blot等实验方法,检测OCT4和VEGF-C的表达情况,分析它们高表达与临床病理特征及预后的关系;实验结果:OCT4和VEGF-C在癌组织中的表达水平显著高于癌旁正常组织,差异具有统计学意义（P＜0.05）;OCT4和VEGF-C高表达与食管癌患者淋巴结转移、TNM分期密切相关（P＜0.05）;OCT4和VEGF-C阳性患者预后较差（P＜0.05）。进一步分析发现VEGF-C与OCT4的表达呈正相关（决定系数R2=0.719,P＜0.05）;实验结论:OCT4和VEGF-C在食管鳞癌组织中高表达,且VEGF-C与OCT4的表达呈正相关;进一步研究发现OCT4和VEGF-C可促进食管鳞癌发生淋巴结转移,导致患者总体生存率降低。第二部分OCT4高表达对食管鳞癌细胞功能学的影响实验材料和方法:在食管鳞癌细胞系Eca109和TE1中,转染OCT4-sh RNA或感染Ad5-OCT4后,通过MTT、Transwell等实验,探讨OCT4对食管鳞癌细胞增殖侵袭的影响。实验结果:OCT4-sh RNA转染食管鳞癌细胞系Eca109,MTT实验提示OCT4-sh RNA组细胞增殖能力显著低于对照组（P＜0.05）,Transwell侵袭实验显示OCT4-sh RNA组侵袭细胞数显著低于对照组（P＜0.001）;Ad5-OCT4感染食管鳞癌细胞系TE1,MTT实验提示Ad5-OCT4组细胞增殖能力显著高于对照组（P＜0.05）,Transwell侵袭实验显示Ad5-OCT4组侵袭细胞数显著高于对照组（P＜0.001）;实验结论:OCT4可促进食管鳞癌细胞增殖侵袭。第三部分OCT4上调VEGF-C表达促进食管鳞癌细胞发生上皮间质转化实验材料和方法:在食管鳞癌细胞系Eca109和TE1中,转染OCT4-sh RNA或感染Ad5-OCT4后,免疫荧光、Western blot检测E-钙黏连蛋白、Vimentin和VEGF-C表达;上调VEGF-C表达后,免疫荧光、Western blot检测E-钙黏连蛋白和Vimentin表达。实验结果:OCT4-sh RNA转染食管鳞癌细胞系Eca109,OCT4-sh RNA组E-钙黏连蛋白（E-cadherin）表达显著升高,而波形蛋白（Vimentin）表达量下降。Ad5-OCT4感染食管鳞癌细胞系TE1,Ad5-OCT4组E-cadherin表达显著下降,Vimentin表达量明显升高,同时VEGF-C表达量上调。Ad5-VEGF-C感染食管鳞癌细胞系TE1,Ad5-VEGF-C组E-cadherin表达显著下降,而Vimentin表达量明显升高。实验结论:上调OCT4表达后,食管鳞癌细胞发生EMT,同时伴随VEGF-C表达量增高;上调VEGF-C表达后,食管鳞癌细胞发生EMT,OCT4可能通过上调VEGF-C促进食管鳞癌细胞发生EMT。第四部分OCT4调控VEGF-C表达促进食管鳞癌上皮间质转化的机制研究实验材料和方法:在食管鳞癌细胞系Eca109、TE1和正常食管癌上皮细胞系HET-1A中,上调或下调OCT4表达,通过荧光素酶报告基因实验测定VEGF-C启动子活性,Western blot检测OCT4调控VEGF-C信号通路相关蛋白表达。建立Eca109裸鼠腹腔内移植瘤模型,OCT4-sh RNA处理后,观察腹腔内移植瘤的数量及生长速度;建立皮下TE1裸鼠成瘤模型,Ad5-OCT4瘤内注射治疗后观察移植瘤的生长速度,取移植瘤标本,免疫组化检测OCT4/VEGF-C/VEGFR-3/p VEGFR-3信号通路蛋白的变化。实验结果:1.下调Eca109细胞OCT4表达,VEGF-C野生型启动子活性明显下降,而突变型启动子活性变化不明显。提高TE1和HET-1A细胞OCT4表达水平,VEGF-C野生型启动子活性增加,突变型启动子活性无明显变化。2.采用sh RNA下调Eca109细胞中OCT4的表达,VEGF-C表达量降低,同时磷酸化VEGFR-3（p-VEGFR-3）水平也下降,反之,使用腺病毒载体提高TE1细胞中OCT4表达水平,VEGF-C表达量升高,同时p-VEGFR-3水平也升高。3.通过建立Eca109裸鼠腹腔内移植瘤模型,下调OCT4表达的Eca109细胞与Eca109亲代细胞相比,腹腔内成瘤的数量和重量明显下降;通过建立皮下TE1裸鼠成瘤动物模型,提高OCT4表达,移植瘤生长速度明显加快,实验组瘤体体积与对照组相比明显增加,取移植瘤标本组织切片,免疫组化结果提示,Ad5-OCT4明显提高了TE1模型移植瘤细胞OCT4表达,癌细胞VEGF-C和p-VEGFR-3的阳性水平明显升高,而VEGFR-3变化不明显。实验结论:OCT4通过调控VEGF-C启动子活性促进食管鳞癌细胞增殖,机制研究显示OCT4可通过调控VEGF-C/VEGFR-3调控细胞EMT进程,进而促进食管鳞癌细胞增殖和侵袭。