角蛋白18(keratin 18,K18)是构成成熟肝细胞骨架的主要中间纤维丝蛋白之一,其主要作用是保护肝细胞免受各种机械性和非机械性的损伤。K18的突变、结构的重组以及磷酸化的改变会影响肝细胞的完整性,引起肝细胞的损伤。此外,K18除了发挥抗机械性损伤作用之外还参与着重要的细胞信号传导作用,包括Fas/FasL、TRADD等相关的凋亡通路都与K18及其磷酸化有关。已有研究发现K18磷酸化水平在慢性丙型肝炎时出现增高,并且增高的程度与肝病进程呈正相关。在我国乙型肝炎病毒(HBV)感染是慢性肝病的最常见病因,关于HBV感染的肝病进展与K18及其磷酸化之间关系的研究在国内外未见报道。因此,研究K18及其磷酸化对揭示HBV感染慢性肝病肝损伤及肝细胞凋亡的机制具有重要意义,对于临床制定个体化的治疗方案、判定预后都具有重要的参考价值和临床应用前景。p53是重要的促凋亡基因,p53及其介导的凋亡通路在HBV感染慢性肝病的肝细胞损伤中发挥着重要的作用。ASPP2(Apoptosis Stimulating Protein 2 of P53, ASPP2)是p53凋亡刺激蛋白家族的重要成员,能够与p53结合选择性地提高p53的促凋亡活性。我们在前期的工作中应用酵母双杂交技术发现,ASPP2能够与K18结合。这一发现对于揭示K18及其磷酸化与肝细胞凋亡的关系和探索其作用方式提供了重要线索。本研究围绕K18及其磷酸化在HBV感染慢性肝病和肝细胞凋亡中的作用及其作用机制进行了系统研究。1、角蛋白18磷酸化在HBV感染慢性肝病中的作用及其意义为了研究K18及其磷酸化在慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)病程进展中的变化及其意义,我们收集了40例慢性乙肝患者肝穿刺组织,21例肝硬化肝组织(其中静止性肝硬化11例,活动性肝硬化10例)和5例慢性重型肝炎肝组织,以12名健康肝移植供体肝组织作为对照。首先应用免疫荧光技术,分析了不同慢性肝病进程当中K18及其磷酸化在肝细胞内的表达和定位,结果发现,K18在正常肝组织中表达水平较高,呈网状分布;慢性肝炎中表达水平无显著变化;但在肝硬化肝组织和慢性重型肝炎肝组织中,其组织正常结构被破坏,许多新生胆管细胞中K18水平较高;K18 Ser33和Ser52在正常肝组织中磷酸化水平较低,但是随着肝损伤程度的增加,在新生胆管细胞中磷酸化水平明显增高。应用Western Blotting的方法检测肝组织中K18磷酸化水平,分组分析K18磷酸化水平与慢乙肝病程进展的关系。(1)将肝组织按照疾病进展分为正常组织,慢性肝炎和肝硬化组。结果发现,K18 Ser52磷酸化水平在正常肝组织中较低,而慢性肝炎组增高,至肝硬化组织达到最高水平;K18 Ser33磷酸化水平在慢性肝炎和肝硬化两组均显著高于正常组织,但两组之间无显著性差异。(2)进一步将40例慢性乙型肝炎患者的肝组织按照Ishak组织学评分的高低分为3组,即轻度损伤(MiH)组、中度损伤(MeH)组、重度损伤(AdH)组,肝硬化组织按照炎症程度分为静止性肝硬化和活动性肝硬化,五组之间进行比较研究其K18磷酸化水平的差异。结果发现,K18 Ser52磷酸化水平随着肝病进程而逐渐增加,从正常肝组织到活动性肝硬化,相邻两组之间有显著性差异。K18 Ser52磷酸化水平变化趋势是:正常组织< MiH < MeH < AdH <静止性肝硬化<活动性肝硬化。K18 Ser33位磷酸化水平从正常组织到活动性肝硬化亦呈上升趋势,在慢性肝炎肝组织中,从轻度损伤至重度损伤,K18 Ser33磷酸化增加明显(p<0.005),但在静止性肝硬化组织中磷酸化水平较低,其水平与MiH组相当(p=0.750),而慢肝中重度损伤组磷酸化水平与活动性肝硬化相当(p=0.715),即K18 Ser33磷酸化水平变化趋势是:正常组织< MiH≈静止性肝硬化< MeH < AdH≈活动性肝硬化。(3)为了进一步探究K18磷酸化与整体肝组织损伤的关系,我们分析了K18磷酸化与临床上最常用的反映肝功能损伤的生化指标谷丙转氨酶(ALT)之间的关系。将本研究中所有慢性乙肝患者的肝组织根据其ALT水平进行分组(1,ALT<40U/L;2,ALT:40~200 U/L;3,ALT>200 U/L),分别与正常肝组织进行比较。结果显示K18 Ser52磷酸化在正常肝组织组、ALT<40U/L组、40~200 U/L组和>200 U/L组中的均值分别为0.73,0.72,1.77和2.71。其中后两组与前两组比较均有显著性差异,而正常组织和ALT<40 U/L组比较无显著性差异(p=0.976),表明在HBV感染但肝功能未受损伤的肝组织中K18 Ser52磷酸化水平并不增加。提示K18 Ser52磷酸化水平反映了肝组织的损伤情况,但与HBV感染本身并无直接联系。而K18 Ser33位磷酸化水平随着肝功能水平变化增高明显,在四组中均值分别为1.02,1.96,2.53和3.00,各组之间存在显著性差异。值得注意的是,在ALT<40 U/L组,K18 Ser33位磷酸化水平也出现增高,与正常相比差异显著。这一结果提示我们,K18 Ser33位磷酸化可能与HBV感染有关系。(4)为了进一步研究HBV感染对于K18磷酸化水平的影响,我们选取了HBV感染但是肝功能水平正常的慢性乙肝携带者的肝组织标本,冰冻切片后分别进行了HBsAg抗体和K18两种磷酸化抗体的双染免疫荧光检测,结果发现,HBsAg在HBV感染的肝细胞胞浆中表达,呈现大面积红染,而在正常对照肝组织中未见染色。K18 Ser33磷酸化恰恰在HBV感染的细胞中出现异常增高,而K18 Ser52磷酸化水平仍然较低,与周围细胞无差异。本研究表明:K18磷酸化水平是慢性乙型肝炎肝损伤的重要指标;K18 Ser52位磷酸化是慢性乙型肝炎肝病进展的判定指标;K18 Ser33位磷酸化可能是HBV感染的早期现象,并且是肝组织炎症损伤程度的判定指标。2、角蛋白18与p53凋亡刺激蛋白2(ASPP2)在肝细胞凋亡中的作用研究我们前期的研究发现,K18能够和p53凋亡刺激蛋白(ASPP2)结合。为进一步证实这种结合关系并研究其对于肝细胞凋亡的意义,我们从三个方面进行了研究。(1)K18及其磷酸化和ASPP2在肝细胞凋亡中的作用研究:应用免疫荧光双染发现,在正常HepG2细胞中,K18和ASPP2均表达在细胞浆中,给予药物处理的细胞发生凋亡时,ASPP2进入到细胞核中,发生核转位。应用不同浓度的甲基甲烷磺酸盐(MMS)作用于HepG2细胞,用Annexin V/PI染色流式细胞法检测细胞凋亡水平,研究K18及其磷酸化和ASPP2在肝细胞凋亡不同状态下的水平变化。结果发现,K18总体水平随着药物浓度增加而降低,ASPP2和K18 Ser52位磷酸化水平随着药物浓度增加而增加,K18 Ser33磷酸化在低浓度药物作用下水平增高,但在高浓度药物作用下反而降低。以上结果说明,ASPP2在肝细胞发生凋亡时出现核转位,从而进入到细胞核中参与p53介导的细胞凋亡通路,而K18的Ser33或Ser52磷酸化水平的变化与肝细胞凋亡有密切关系。(2)ASPP2与K18结合功能区域的确定:采用重组的GST-mASPP2,ASPP2 N-末端和C-末端融合蛋白分别与K18融合蛋白进行免疫共沉淀。实验结果发现ASPP2的N-末端能够与K18结合。进一步将ASPP2的N-末端逐步截短,表达了ASPP2 N-末端的截短小片段融合蛋白,再次与K18进行体外免疫沉淀反应,结果发现,ASPP2的N-末端位于83-105个氨基酸残基之间正是与K18结合的关键部位,而其下游的氨基酸残基则与结合能力有关系。应用293T细胞分别高效转染K18-pcDNA4或K18 S33A、K18 S52A,提取细胞总蛋白应用GST-mASPP2融合蛋白进行免疫沉淀反应,结果发现,ASPP2能够与K18结合,但在转染突变K18的细胞中结合降低,在转染S33A突变K18的细胞中结合最少。提示这种结合可能与33位的丝氨酸磷酸化有关系。为了研究这种结合与肝病进展的关系,我们提取了活动性肝硬化和静止性肝硬化肝组织的总蛋白,利用免疫共沉淀技术分析了K18和ASPP2的结合水平与肝病进展的关系,结果发现,ASPP2在静止性肝硬化中与K18的结合更强,在活动性肝硬化结合显著减少。说明,在肝组织受到严重损伤时,ASPP2与K18的结合减少。(3)K18与ASPP2结合作用方式的初步研究:将细胞共转染ASPP2和K18或S33A,S52A定点突变的K18,给予细胞药物刺激,转染S33A K18的细胞发生凋亡时,ASPP2全部进入到细胞核中,而转染K18和S52A K18的细胞发生凋亡时,ASPP2部分进入到核中,大部分仍然位于细胞浆中,说明K18 Ser33位磷酸化与ASPP2的核转位有关。应用报告基因分析法研究K18对ASPP2-p53及其调控的下游分子Bax转录活性的影响。结果发现:ASPP2的存在能够显著提高p53刺激的Bax-luc报告基因活性,当加入过量野生型K18后,Bax-luc报告基因活性大大减低,提示K18可能参与了抑制ASPP2的促p53转录激活作用;当用K18 S33A质粒替代K18后,Bax-luc报告基因活性水平与ASPP2单独存在时大致相同。这一结果再次提示K18 Ser33位磷酸化能够促进K18与ASPP2的结合,从而间接抑制ASPP2与p53的结合而发挥凋亡抑制作用。上述实验研究表明:K18磷酸化在肝细胞凋亡中发挥着重要的作用;正常情况下K18在细胞浆中以Ser33位磷酸化依赖的方式结合ASPP2,在细胞遇到轻度损伤性刺激时,K18 Ser33和Ser52位磷酸化水平均出现增高,使得ASPP2与K18的结合水平增加;但当细胞受到严重刺激时,K18 Ser33位磷酸化水平反而降低,导致ASPP2与K18的结合变得松弛,ASPP2进入到细胞核与p53结合中发挥其促凋亡的作用。