ATGL真核质粒构建和在肝癌细胞中作用研究

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肝癌是临床常见的恶性肿瘤,包括原发性肝癌(primary liver cancer,PLC)和继发性肝癌(secondary liver cancer,SLC)。我国是肝癌发病率和病死率最高的国家,发病人数占全球50%以上,死亡率占45%,居全球第一。目前,原发性肝癌首选的治疗方法是手术,但大部分患者发现时,已经是晚期,失去了手术时机。肝癌一旦发生转移,其5年生存率只有15%。原发性肝癌患者经化学治疗、射频消融及中医药治疗等手段综合治疗可提高患者的生存率,改善生活质量,但是疗效并不如人意。增殖和转移是肝癌恶性特性之一,靶向治疗肝癌增殖和转移在一定程度上能抑制肝癌进展,改善患者的生活水平。但是,目前并没有明显有效抑制肝癌增殖和转移的药物;为寻找新的靶点来抑制肝癌增殖和转移,我们研究了ATGL在肝癌中作用,为将来可能靶向ATGL治疗肝癌提供理论基础和实验依据。本文首先根据Pubmed上ATGL的序列设计引物,以肝癌cDNA为模板,PCR钓取ATGL基因,通过分子克隆构建在pcDNA3.1+载体上,测序验证其构建成功。在肝癌细胞株上转染ATGL质粒,得到高表达,其mRNA水平为对照组近2万倍。成功构建ATGL真核表达质粒并在肝癌细胞中成功表达后:用MTT法和平板克隆形成实验检测其增殖能力影响;用划痕实验和迁移实验检测其对肝癌转移能力影响;用Western blot检测p-AKT和p-ERK水平。从这三个方面具体展开研究:第一,MTT法:ATGL瞬时转染肝癌细胞株HepG2、Hep3B后24 h,48 h,72 h,用酶标仪测定OD570与对照组相比光密度值都有增加。平板克隆形成实验:在肝癌细胞中过表达ATGL,悬浮稀释细胞,单一种植于细胞培养皿中,继续培养7天,肝癌细胞HepG2克隆数量和大小与对照组相比明显增多、增大。第二,划痕实验:HepG2细胞转染ATGL质粒,24h后其长满整个培养皿,划痕处理,PBS洗去漂浮细胞,重新培养24 h与对照组相比,细胞爬满划痕的程度一致。迁移实验:在肝癌细胞HepG2转染ATGL质粒24 h后,消化后种植于Boyden transwell小室中;Migration assay结果显示穿过小室的细胞与对照组的数量一致。第三,在Hep G2细胞里过表达ATGL质粒,24 h后收集蛋白,western blot分别检测p-AKT水平与p-ERK水平(β-actin为内参蛋白),表明了ATGL能促进AKT磷酸化,而对ERK磷酸化没有影响。我们成功构建ATGL真核表达质粒并在肝癌细胞中成功表达;ATGL能明显促进肝癌增殖,而没有影响肝癌转移作用(与对照组相比);ATGL促进p-AKT水平升高,而不影响p-ERK水平,表明ATGL可能通过调控p-AKT信号通路进而促进肝癌细胞增殖。
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