研究背景：心肌梗死(myocardial infarction, MI)是一种常见的严重的缺血性心脏病,严重危害人类健康。近年来,尽管介入治疗和药物治疗的快速发展为改善心肌缺血提供了帮助,但不能使梗死区的血管再生。大量基础实验和临床研究表明,间充质干细胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)移植治疗可促进梗死部位的血管新生和心肌再生,改善心肌梗死后心功能,为缺血性心脏病的治疗带来新的希望。但目前干细胞移植存在的主要问题是移植干细胞的迁移归巢能力差,移植效率低下,阻碍了其在临床应用中的推广多项研究显示,超声靶向微泡击破(Ultrasound targeted microbubble destruction, UTMD)有助于增强干细胞的移植效率及归巢能力,进一步提高干细胞移植治疗心肌缺血的效果。至于UTMD促MSCs迁移归巢的机制,目前的研究主要集中于针对靶组织形态结构和微环境改变的在体研究,包括微泡介导的超声辐照可使心肌血管通透性增加,有助于干细胞从血管内迁移归巢到靶组织,超声联合微泡引起的局部炎症反应可改变组织局部微环境,使其更适于MSCs着床”等。而UTMD对干细胞本身的作用影响及具体分子机制方面的探讨比较少。已知SDF-1/CXCR4轴是干细胞靶向归巢的重要分子通路,SDF-1及其受体CXCR4在心肌损伤修复过程MSCs的动员、迁移和归巢中均发挥了重要的作用。本研究拟从SDF-1/CXCR4的角度探索UTMD促MSCs迁移归巢的作用及其分子机制,探讨携SDF-1微泡联合超声在促MSCs归巢及改善心肌缺血后心功能的作用,这一机制的阐明将为超声联合微泡作用下移植MSCs有效归巢缺血心肌及修复作用提供理论依据。研究目的：1.探讨UTMD调节SDF-1/CXCR4轴促静脉移植MSCs迁移归巢的作用及可能分子机制,为超声联合微泡作用下移植MSCs有效归巢缺血心肌提供理论依据；2.探讨诊断超声联合携SDF-1微泡促静脉移植的MSCs归巢缺血心肌,改善大鼠心肌梗死后心功能的可行性和有效性,并初步探讨其机制。研究方法：1.人骨髓源性与大鼠骨髓源性间充质干细胞的分离、培养、鉴定及标记分别通过密度梯度离心法和全骨髓贴壁培养法对成人骨髓源性间充质干细胞(Bone marrow derived mesenchymal stem cells, BMSCs)和大鼠BMSCs进行分离、纯化及培养,前者用于体外机制研究,后者用于动物体内的细胞移植。检测细胞周期、细胞生长曲线、超微结构。流式细胞仪检测细胞表面标记分子,成脂及成骨诱导分化对细胞进行鉴定。为在动物体内示踪外源性MSCs,用携带增强型GFP的慢病毒转染大鼠MSCs,转染48h后观察MSCs的绿色荧光表达及细胞毒性反应。2.大鼠急性心肌梗死模型的建立与评价采用结扎冠状动脉左前降支的方法建立大鼠心肌梗死模型。模型评价方法：HE染色、Masson染色以及超声心动图检测左室收缩功能。3. UTMD上调SDF-1/CXCR4表达促心肌梗死后MSCs迁移归巢的机制研究(1)体外辐照参数筛选：按照均匀实验设计,考察影响超声辐照效果的三个主要参数：超声辐照时间、辐照强度和微泡浓度。通过对SDF-1分泌量和人MSCs细胞存活率的检测,优选最佳的体外辐照参数配比。(2)体外部分机制研究：本部分实验全部使用成人MSCs。为充分验证研究假设,制备两种条件培养液用于体外模拟正常或缺氧的心肌环境：①正常氧含量或低氧含量环境下人心肌细胞和人心肌微血管内皮细胞共培养的上清液；②正常或MI大鼠心肌组织提取液(myocardial tissue extracts, MTE)。据此把体外机制实验分为“上清液部分”和“MTE部分”。运用优化的超声辐照参数,考察UTMD对不同条件培养液中MSCs的影响。考察指标包括：CCK-8法检测MSCs的存活率,ELISA法检测SDF-1、黏附分子VCAM-1和ICAM-1的表达量,流式细胞仪检测MSCs膜CXCR4表达,Western blot法检测MSCs胞内CXCR4蛋白表达,荧光实时定量PCR法检测MSCs的CXCR4基因表达水平,Transwell迁移实验评估MSCs的体外迁移能力。(3)体内部分机制研究：本部分实验使用大鼠MSCs。GFP标记的MSCs移植MI大鼠48h后,观察外源性MSCs在静脉移植MSCs组和超声联合微泡+MSCs组缺血心肌区的荧光分布,并计数阳性细胞用于统计学比较；未进行GFP标记的MSCs移植MI大鼠7d后,免疫组化法和Western blot法检测各组(对照组、静脉移植MSCs组、超声+微泡组以及超声+微泡+MSCs组)心肌缺血区SDF-1和CXCR4的表达。4.超声联合携SDF-1微泡促MSCs靶向归巢并改善大鼠心肌梗死后心功能的研究(1)携SDF-1微泡的制备及检测：在本科室普通脂质微泡制备方法的基础上,用共价结合法制备携SDF-1的微泡,光镜观察其形态、分布,颗粒计数仪检测其粒径、浓度,流式细胞仪检测SDF-1携带率、ELISA法检测SDF-1携载量和包封率。(2) UTMD对缺氧预处理MSCs的影响：本部分实验使用成人MSCs,考察微泡联合超声对缺氧预处理MSCs的影响。将MSCs置于低氧环境(1% O2,94% N2,5% CO2)中暴露24h进行缺氧预处理。超声辐照后用CCK-8法检测细胞存活率、流式细胞仪检测膜CXCR4表达、Transwell迁移实验评估其体外迁移能力。(3)动物实验：本部分实验全部使用缺氧预处理的大鼠MSCs用于移植治疗。GFP标记的MSCs移植48h后,观察外源性MSCs在静脉移植MSCs组、MSCs+UM组(普通微泡)以及MSC+UMSDF-1组(携SDF-1微泡)缺血心肌区的荧光分布；未进行GFP标记的MSCs移植28d后,免疫组化法检测各组(对照组、静脉移植MSCs组MSC+UM组以及MSC+UMSDF-1组)心肌缺血区肝细胞生长因子(HGF)的表达,Western blot法检测SDF-1和血管内皮细胞生长因子(VEGF)的表达水平,HE染色法检测心肌缺血区血管密度(capillary density, CD), M型超声评价左室收缩功能。结果：1.成人骨髓源性与大鼠骨髓源性间充质干细胞的分离、培养、鉴定及标记培养的成人MSCs和大鼠MSCs均贴壁生长,以梭形和纺锤形为主。成人MSCs高表达CD44(95.25%)和CD105(99.98%),几乎不表达CD34(0.44%)和CD45(4.86%)。大鼠MSCs强阳性表达CD29 (94.88%), CD44 (99.96%)以及CD90(99.86%),几乎不表达CD34 (0.48%), CD45 (4.17%)和CD11b(4.63%)。成人MSCs和大鼠MSCs成脂诱导14d后油红O染色均显示胞浆脂滴形成,成骨诱导21d后茜素红染色均显示钙结节形成。选择感染复数(multiplicity of infection, MOI)为10进行GFP转染,转染后48h绝大部分大鼠MSCs的胞浆和胞核呈现明亮的绿色荧光。转染后MSCs生长良好,仍为纺锤形或梭形,未见明显毒性反应。传代后绿色荧光表达稳定。2.大鼠急性心肌梗死模型的建立与评价冠脉左前降支结扎法成功建立MI模型,Masson染色示左室前壁梗死区为蓝色染色,非梗死区为红色染色,二者界限分明。超声心动图检测示左室射血分数(ejection fraction, EF)和短轴缩短率(fractional shortening, FS)显著降低,提示心肌梗死后大鼠左室收缩功能明显降低。3.微泡介导的超声生物学效应上调SDF-1/CXCR4表达促心梗后MSCs迁移归巢的机制研究(1)体外辐照参数筛选：超声联合微泡促人MSCs分泌SDF-1的最佳辐照参数：频率=1MHz,辐照时间(T)=30s,辐照强度(Q)=0.6W/cm2,微泡浓度(MB)=106/mL时,MSCs分泌SDF-1(551.67±40.88)pg/mL和细胞存活率(88.51±4.03)%达到一个相对匹配的数值。此参数配比即用于后续体外部分的实验。(2)体外部分机制研究：使用人MSCs和两种条件培养液进行机制研究,“上清液部分”和“MTE部分”检测的各个指标的组间统计学差异基本一致。具体结果如下：①SDF-1的ELISA结果：缺氧的条件培养液可使MSCs分泌SDF-1增加,微泡联合超声可进一步促进SDF-1的分泌。以“上清液部分”为例,缺氧上清液本身即含有较高浓度的SDF-1(344.89±74.93pg/mL),与MSCs共培养后SDF-1增加了约34%(462.51±101.07 pg/mL),微泡联合超声作用后进一步增加了约22%(563.75±76.22pg/mL),而细胞存活率仅下降了约7～9%；②流式细胞仪检测MSCs膜CXCR4表达结果：微泡联合超声辐照可使体外培养的MSCs膜CXCR4表达上调,在心梗MTE培养条件下的上调作用尤为明显,表达膜CXCR4的MSCs比例达到了(12.45±2.73)%,是超声作用前(8.34±1.33%)的1.49倍,是对照组(0.56±0.19%)的22.23倍。③CXCR4的qPCR及Western blot 检测结果：MSCs经微泡联合超声作用后,CXCR4 mRNA和蛋白的表达水平均有显著提高,缺氧条件培养液+UTMD组的表达水平最高,与其他组相比P<0.01。④黏附分子的ELISA检测结果：微泡联合超声作用于与缺氧上清液培养的MSCs, VCAM-1和ICAM-1的浓度分别增加了34%和40.2%,作用于与心梗MTE培养的MSCs, VCAM-1和ICAM-1的浓度分别增加了53.9%和51.7%。⑤Transwell体外迁移实验结果：经微泡联合超声作用后的MSCs,其体外迁移能力显著高于其他未经超声处理的MSCs,但MSCs与SDF-1/CXCR4阻断剂AMD3100孵育后迁移细胞数显著下降,与对照组相比无显著统计学差异(P>0.05)。(3)体内部分机制研究：① GFP-MSCs归巢数量的定量分析：对各实验组大鼠经静脉移植MSCs 48h后,激光共聚焦显微镜下微泡联合超声-HMSCs移植组和MSCs静脉移植组缺血心肌区均有带绿色荧光的阳性细胞分布,计数分别为(41.27±6.34)个和(29.23±4.08)个,差异有统计学意义(P<0.01)。② SDF-1和CXCR4的免疫组化结果：SDF-1和CXCR4主要分布于缺血心肌及其周边组织,在对照组分布较少,MSCs组和超声+微泡组分布增多,而超声联合微泡+MSCs组有最多的阳性细胞分布。③SDF-1和CXCR4的Western blot结果：心肌缺血区SDF-1和CXCR4的表达量在超声联合微泡+MSCs组最强,与其他三组相比均有显著统计学差异,P<0.01; MSC组和超声+微泡组与对照组相比显著增加,P<0.01。4.超声联合携SDF-1微泡促MSCs靶向归巢并改善大鼠心肌梗死后心功能的研究(1)携SDF-1微泡的生物特性检测：成功制备的携SDF-1微泡光镜下呈圆球形,分布均匀,微泡直径范围为1.5-5μm,平均直径1.92μm,浓度为2-6×109/mL。FITC标记SDF-1后,流式细胞仪检测微泡SDF-1的携带率为79.74%。ELISA测得SDF-1的包封率为79%,携载量为15.8ng/mL。(2) UTMD对缺氧预处理MSCs的影响：①流式细胞仪检测MSCs膜CXCR4表达结果：缺氧培养24h后,MSCs的膜CXCR4表达率(8.52±2.17%)与正常培养的MSCs (0.86±0.21%)相比显著增加(P<0.01),而细胞存活率没有明显变化；超声联合微泡作用后,缺氧预处理MSCs的膜CXCR4表达进一步增高至(15.62±3.65)%,细胞存活率仅下降约9%-10%。②Transwell体外迁移实验结果：超声联合携SDF-1微泡作用后迁移的MSCs个数(184.57±19.52)显著多于超声联合普通微泡辐照组(95.25±9.21)和对照组(43.13±6.86),两者P<0.01,但MSCs与AMD3100共孵育后迁移细胞数显著减少为(62.34±8.95),P<0.01。(3)动物实验结果：① GFP-MSCs归巢数量的定量分析：激光共聚焦显微镜测得MSC+UMSDF-1组归巢的GFP-MSCs个数为(58.33±13.51),是MSC+UM组(45.92±8.08)的1.27倍,MSC组(27.46±5.21)的2.12倍(三者P<0.01)。②血管密度分析结果：HE染色结果示MSC+UMSDF-1组血管最多,分布密集,显著多于对照组、MSC组及MSC+UM组,三者P<0.01。③免疫组化法半定量检测HGF表达结果：MSC+UMSDF-1组累积光密度为45014.66±6230.07,显著高于对照组(5791.51±834.12)、MSC组(18786.90±1229.33)、及MSC+UM组(32879.28±3851.45),三者P<0.01。④Western blot检测结果：MSC+UMSDF1组SDF-1和VEGF表达水平最高, MSC+UM组次之,MSC组再次,对照组表达最少。⑤左室收缩功能检测结果：M型超声测得MSC+UMSDF-1组LVEF值为(67.83±5.78)%,显著高于对照组(39.80±4.51%)、MSC组(48.74±3.13%)以及MSC+UM组(58.83±5.50 %),P<0.01。MSC+UMSDF-1组FS值为(43.58±4.94)%,显著高于对照组(20.73±2.83%)和MSC组(31.01±3.94%),P<0.01,与MSC+UM组(39.84±3.68%)相比,差异有统计学意义,P<0.05。结论：1.成功实现成人MSCs和大鼠MSCs的分离、纯化、培养及鉴定。按照MOI=10可成功转染携带增强型GFP的慢病毒到大鼠MSCs,转染效率高且传代后荧光表达稳定,可标记MSCs用于体内示踪。2.使用优选出的体外超声辐照参数(频率=1MHz, T=30s, Q=0.6W/cm2, MB=106/mL),微泡联合超声作用于人MSCs,可在较高细胞存活率的前提下,促进SDF-1及黏附分子VCAM-1和ICAM-1的分泌。还可上调MSCs膜CXCR4的表达,这可能得益于超声“声孔效应”和超声辐照后MSCs胞内CXCR4储备的增加。3.采用缺氧条件下心肌细胞和心肌血管内皮细胞上清液与心肌梗死组织提取液两种条件培养液与MSCs进行共培养,均证实UTMD是通过上调SDF-1/CXCR4表达促MSCs归巢迁移这一分子机制。4.诊断超声联合微泡作用于MI模型大鼠,可促进经静脉移植的MSCs向缺血心肌归巢,并提高缺血心肌区SDF-1、CXCR4的表达。其中,SDF-1的高表达可能是微泡介导的超声生物学效应作用于靶区和UTMD上调MSCs旁分泌共同作用的结果。5.靶区SDF-1表达量的增加,与外源性MSCs在超声作用下膜CXCR4的表达上调,可能是UTMD上调SDF-1/CXCR4表达从而促进MSCs迁移归巢的两个相互作用的关键分子靶点。6.采用共价连接法可成功制备粒径小,浓度高,分布均匀,连接稳定,有较高携载量和包封率的携SDF-1微泡。7.缺氧预处理可使MSCs膜CXCR4表达上调,微泡联合超声作用可进一步促进其功能性表达,均有利于MSCs的迁移、归巢。8.携SDF-1微泡在超声作用下靶向释放形成的SDF-1局部高浓度,和缺氧预处理及超声辐照引起的MSCs膜CXCR4表达上调,二者相互作用,共同促进外源性MSCs迁移归巢到缺血心肌。9.经静脉移植MSCs在携SDF-1微泡联合超声作用下,归巢的MSCs数量进一步增加,并通过超声空化效应和归巢MSCs的旁分泌效应提高心肌缺血区VEGF和HGF的表达,促进血管新生来改善血流灌注,更有效改善心肌缺血后心功能。