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霉菌是我国传统豆类发酵食品的主要生产菌种，有着悠久的应用历史。由于长期受到环境条件（高蛋白培养基）的驯化，这些霉菌具有分泌多种胞外蛋白酶的能力；这些胞外蛋白酶对植物蛋白具有高效的水解能力，特别对大豆蛋白而言，水解产物无苦味且水解程度高。目前，国内外学者对霉菌的研究主要集中于优化固体（或者液体）发酵条件来提高霉菌蛋白酶的产量或对酶学性质的研究；而对霉菌蛋白酶基因的克隆表达方面的研究鲜有报道。鉴于此，本课题对几种霉菌蛋白酶基因进行了克隆表达、定点突变和水解大豆分离蛋白等方面的研究。利用RACE和PCR技术从Actinomucor elegans、Rhizopus chinensis、Aspergillus niger和Aspergillus oryzae等几种霉菌中克隆获得3个新氨肽酶基因（GenBank登录号分别为HQ825158、JQ657815和JQ657814，下同）、2个新丝氨酸蛋白酶基因（GU356536和JF922913）；进一步获得4个丝氨酸蛋白酶基因（L19059、XM001391433、XM001824768和XM001820092）、5个酸性蛋白酶基因（XM001399818、XM001401056、D13894、AB090877和AB044079）和1个中性蛋白酶基因（AF099904）。本试验共克隆获得15个蛋白酶基因。根据生物信息学的理论和方法，对这些蛋白酶基因进行了较全面的预测和分析。结果表明，这些蛋白酶基因的密码子偏好性均不相同，并且编码的氨基酸残基长度也不一致。6种丝氨酸蛋白酶属于蛋白酶K家族，亲缘关系较近；以蛋白酶K晶体结构（PDBcode:1IC6A）作为模板进行同源建模分析可知：这些蛋白酶分子内均无二硫键，具有1个Ca2+结合位点；蛋白酶之间以及与蛋白酶K在底物结合区域、氢键、盐键和二硫键等方面均存在差异，这些差异可能是这些酶具有独特水解作用的原因。5种酸性蛋白酶属于酸性蛋白酶Asp家族，是胞外蛋白酶，亲缘关系较近；以Aspergillopepsin I晶体结构（PDB code:1IBQ B）作为模板进行同源建模可知：蛋白酶分子内均有1个二硫键，具有1个Zn2+结合位点。蛋白酶之间在活性位点的溶剂可及表面积、氢键、盐键、底物结合区域和ψ-loop结构等方面均存在差异，这些差异可能使这些蛋白酶具有独特的酶学性质。对中性蛋白酶和氨肽酶的功能位点、Motif结构和进化关系进行了分析；由于中性蛋白酶和氨肽酶未具有较为适合的同源建模模板，因此未能构建模拟出二级结构和三级结构的模型。分别将A. elegans、R. chinensis的Alp基因、A.niger的AlpI基因、A. oryzae的AlpII基因和A. elegansAmp基因克隆至表达载体pET-22b（+）上，转化至大肠杆菌BL21菌株中进行诱导表达；结果表明这些蛋白酶基因均被诱导表达出未有活性的重组蛋白酶。将蛋白酶基因克隆至表达载体pPIC9K上，电转整合至毕赤酵母Km71菌株的基因组上进行诱导表达。结果表明只有A.niger的AlpI基因、A.oryzae的AlpII基因和NpI基因能成功表达。进一步分别对3种重组蛋白酶进行了分离纯化和酶学性质研究。结果表明：重组黑曲霉AlpI在10L发酵罐中诱导表达时，发酵液的蛋白酶酶活达到4050U/mL，该酶最适反应pH值和温度分别为8.0-9.0和45℃，在pH为6.0-9.0和温度低于40℃时具有较好的热稳定性，PMSF完全抑制酶活，Ca2+、Mn2+和K+对酶具有促进作用，Zn2+、Fe2+和Mg2+都具有抑制作用。重组米曲霉AlpII在10L发酵罐中诱导表达时，发酵液的蛋白酶酶活达4100U/mL；该蛋白酶最适反应pH值和温度分别为8.5-9.5和50℃，在pH值为6.0-10.0和温度低于40℃时具有较好的稳定性；PMSF完全抑制酶活；Ca2+和Mg2+具有促进酶的作用，Zn2+、Fe2+和Mn2+具有轻微的抑制作用。重组米曲霉NpI在10L发酵罐中诱导表达时，发酵液的蛋白酶酶活达43101U/mL；该酶最适反应pH和温度分别为8.0和55℃，在pH为5.0-9.0和45℃以下具有较好的稳定性，EDTA强烈抑制酶活，Cu2+和Zn2+能显著的抑制酶活。为了提高重组蛋白酶的热稳定性利于工业的开发利用，采用定点突变技术来增加蛋白酶的二硫键。结果表明：重组米曲霉AlpII的突变酶G33C-S126C（将33位点和126位点氨基酸G和S突变为C）提高了热稳定性；但是突变酶I179C-T253C的热稳定性发生了降低；突变酶G33C-S126C-179C-T253C不能被表达。重组黑曲霉AlpI的3种突变酶（G34C-S127C、I180C-T254C和G34C-S127C-180C-T254C），均不能在毕赤酵母KM71菌株中成功表达。对米曲霉NpI的“HExxH19aaE”Motif结构中的活性位点（H429、H433和E453）进行一系列的突变，结果表明该3个位点对NpI非常重要，进一步说明该酶属于锌蛋白酶家族。以大豆蛋白为底物，考察了重组蛋白酶对大豆分离蛋白的水解能力。结果表明重组米曲霉ApII最佳温度、pH值、水解时间和加酶量分别为45℃、10.0、1-1.5h和1000U/g，此时大豆分离蛋白水解度为15.8%。重组黑曲霉ApI最佳的温度、pH值、水解时间和加酶量分别为40℃、10.0、1h和1000U/g，此时的大豆分离蛋白水解度为15.6%。重组米曲霉NpI最佳的温度、pH值、水解时间和加酶量分别为45℃、8.0、1-1.5h和1500U/g，此时的大豆分离蛋白水解度为16.4%。