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器官移植作为治疗终末期器官衰竭患者的一种较有效的方法,在临床上得到了越来越广泛的应用,这也使人类器官供体相对缺乏的状况越来严重,激起人们对异种移植的强烈兴趣。然而,异种移植后将出现比同种异体移植更复杂的排斥反应。如何解决是保证异种器官移植成功关键因素。移植器官“寄生虫化”,及移植器官表达寄生虫某些分泌蛋白,使移植物能模拟寄生虫产生“免疫逃避”,从而长时间在受体内成活,这一策略为解决异种器官移植排斥反应提供了新思路。皮蝇素是一种可降解补体的丝氨酸蛋白酶,它们在寄生虫和宿主相互关系之间起着重要作用。帮助寄生虫应对宿主组织的侵袭,帮助逃避宿主的免疫系统。本研究通过转基因动物方式,使移植器官分泌皮蝇素A、C蛋白酶,建立移植器官“寄生虫化”动物模型,应用此模型进一步研究皮蝇素与补体系统作用机制。移植器官分泌皮蝇素抑制受体补体激活,调节各种异种移植排斥反应,延长移植物存活时间,为解决异种器官移植排斥反应提供新途径。1.皮蝇素分泌型真核表达载体的构建构建分泌型真核表达载体pEF1-CD-HA-AcGFP和pEF1-CD-HC-AcGFP,该载体以EF1为启动子,牛皮蝇一期幼虫RT-PCR扩增出HA、HC基因cDNA为目的基因,序列上游融合IgK-chain secretion signal信号肽序列。将融合基因序列插入PEFla-IRES-AcGFP多克隆位点,应用核酸内切酶EcoR I和BamH I双酶切,构建pEFl-CD-HA-AcGFP和pEF1-CD-HC-AcGFP重组分泌型真核表达载体。将构建好的质粒测序,正向反向测序结果与预期符合,用于下一步体外转染实验和转基因实验。2.皮蝇素A抗体的制备及鉴定皮蝇素A(Hypodermin A HA)具有很好的免疫原性,以其作为免疫抗原,可以使被免疫的动物产生对牛皮蝇幼虫的感染具有保护性的抗体。利用生物信息学对HA的抗原性及其亲水性进行分析,提示该氨基酸具有较好的抗原性。并发现抗原表位主要分布在氨基酸的C端101-116,161-173,37-50的三个区域。通过RP-HPLC方法测定人工合成的多肽发现其纯度达到91.2%,并通过质谱鉴定分子量与预计的分子量吻合为28 kD。然后与KLH连接,免疫新西兰大白兔,得到了HA的多肽抗体。采用ELISA和western blotting方法验证了抗体的特异性。ELISA结果显示制备的HA多肽抗体特异性识别多肽,且滴度较高。并同时从牛皮蝇一期幼虫中提取蛋白,对制备抗体、阴性血清和阳性血清进行western blotting检测,结果发现制备抗体和阳性血清分别在28KD处有目的条带,而阴性血清没有目的条带。制备得到的HA多克隆抗体。为进一步研究HA的分子功能,提供了有用的工具。3.皮蝇素转基因表达载体体外转染实验pEF1--CD-HA-AcGFP和pEF1--CD-HC-AcGFP体外转染及抗补体损伤研究,应用脂质体法转染Cos7细胞,RT-PCR与western blot检测HA、HC是否成功表达；并用G418筛选得到了HA和HC的稳定表达细胞株。免疫共沉淀实验检测HA与C3是否相互作用。HA稳转细胞分别与10%、40%的豚鼠血清37℃孵育100 min,western blot与ELISA方法结果显示,占比为10%的豚鼠血清与HA稳转细胞孵育后,HA组较阴性对照达到了极显著水平。免疫共沉淀实验发现HA与C3相互作用。通过EMSA实验发现,HA通过主链底物结合位点(S225,T226,G227)与C3相互作用。同样将HC稳转细胞分别与10%、30%、50%的豚鼠血清37℃孵育100 min,western blot与ELISA方法结果显示,占比为10%及30%的豚鼠血清组中,HC组较阴性对照达到了显著水平。EMSA实验发现,HC通过结合位点(S229,G230,A231)与C3相互作用。4.皮蝇素转基因模型鼠的制备显微注射法制备转基因小鼠,Apal I, StuI内切酶双酶切pEF1-CD-HA-AcGFP, pEF1--CD-HC-AcGFP,回收序列为基因构件,显微注射入FVB小鼠和C57BL/6J小鼠受精卵雄性原核内,移植至假孕母鼠输卵管,小鼠出生后剪尾提DNA,分别设计引物PCR检测目的基因HA、HC。结果显示,HA获得4只阳性首建鼠,HC获得9只首建鼠,阳性鼠分别与正常FVB小鼠和C57BL/6J小鼠杂交扩群。5.模型鼠器官异种移植、抑制移植排斥反应研究皮肤通常是高度敏感的,皮肤移植通常被认为是会引起非常强的排斥反应,本研究中,将HA转基因小鼠来进行小鼠皮肤移植实验,来研究HA的免疫抑制作用及对补体成分的影响。结果发现,HA转基因小鼠皮肤移植存活的时间与对照组相比明显延长,表明在体内HA也具有较好的免疫抑制作用。研究发现HA通过裂解补体C3,延长补体活化,从而降低同种异体移植物的排斥,降低潜在的有害影响。本研究结果中清楚地表明,在HA转基因小鼠皮肤移植中C3,C9,CD4和B7-2等含量与对照组相比显著降低。延长了HA转基因小鼠皮肤移植物的存活。在一些炎症过程中,补体成分也是一个关键的因素。根据本研究中移植皮肤炎症期的记录和HE染色结果表明,皮肤移植后炎症期峰值是出现在1-4d之间,各组间的炎性细胞浸润有比较显著的差异。综上所述,HA与HC均具有免疫抑制的特性,HA与HC在体外均可以抑制补体的活性,降低细胞介导的抑制。体内实验结果表明,HA在转基因皮肤移植小鼠模型的实验中体现了比较重要的作用。与对照组相比,HA转基因小鼠的皮肤移植存活时间明显延长,表明HA在应用于提高移植物的存活时间上可能是个不错的选择。今后我们将进一步深入的研究HA、HC作为可延长供体器官生存的基因治疗或药物的潜力。