白内障是世界的首要致盲性眼病，随着人口年龄结构的增长，白内障成为老年人致盲的重要原因。统计资料表明老年性白内障的发生率占老年性眼病的1/4。目前有效的治疗方法为手术摘除混浊的晶状体，尽管随着手术技术、手术器械的不断发展，白内障手术变的越来越普遍，近年来仍有许多研究人员致力于白内障病因学的基础研究，且大量工作集中于发病机制及后发障的研究，故力图从发病机制入手，有效的防治白内障逐渐成为许多眼科工作者所热衷的白内障治疗的新领域。在白内障发病的过程中，晶状体上皮细胞(LEC)起到了关键的作用，任何能够影响其形态结构、生理功能的因素都可能参与白内障的形成过程。　　 富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白(Secreted protein acidic and rich in cysteine，简称SPARC)是一种多细胞分泌的小分子蛋白。最早是由Termine等作为一种牛和入骨组织中的非胶原组分发现并描述的。近二十年来，根据不同的命名依据，SPARC又被称作43K(依据蛋白的大小)，BM(基底膜)-40(根据组织来源)，骨连接素(根据其与骨基质具高亲和力的生化特性)。SPARC属于细胞外基质蛋白家族。SPARC基因显示为单拷贝基因，人类的SPARC位于5q31-33。脊椎动物SPARC的cDNA编码的蛋白含有298-304个氨基酸，是在一个含有77个氨基酸的信号肽序列后跟随了一个含283-287个氨基酸残基的隐匿部分。Engel等提出SPARC含有四个不同的区域。区域Ⅰ(氨基酸残基3-51)，由外显子3和4编码，富含酸性并有5-8个Ca++结合位点，但亲和性相对较低，此区域的α双螺旋结构对Ca++浓度的生理性流出敏感。区域Ⅱ(氨基酸残基52-132)，由外显子5和6编码，富含半胱氨酸，与folliststin的同源性很高，该区域尚有GHK序列及2个Cu++结合位点，参与细胞增殖的调节。区域Ⅲ(氨基酸残基133-227)外显子7和8编码，被认为是α螺旋片段的延伸系列，并含有内源性蛋白酶的酶切位点。位于此区域N端的Cys137以二硫键与区域Ⅳ的Cys247结合。区域Ⅳ(氨基酸残基228-285)，含有由外显子9编码的EF臂，具有高钙亲和力位点。SPARC的生物学特性如下：1、抗增殖和粘附作用：2、调节细胞和细胞外基质的相互作用；3、与细胞因子结合及相互作用；4、影响生物体的发育；5、影响损伤愈合及血管发生。　　 近年来对SPARC的研究主要集中在肿瘤领域。SPARC对细胞有抗黏附、抑制增殖的作用，国内外相关的研究多是集中于其对各种肿瘤细胞、角质形成细胞、肾脏囊肿衬里上皮细胞、视网膜色素上皮细胞等的抑制作用，尚无研究直接观察外源性的SPARC对体外培养的人晶状体上皮细胞生物学行为的影响。本研究采用多种方法观察了SPARC对人晶状体上皮细胞增殖、黏附、移行的影响，并检测了外界的不同刺激对晶状体上皮细胞中SPARC表达的影响，而后又对比了临床上正常人及不同年龄组的白内障患者的晶状体上皮细胞中SPARC表达，探讨其在白内障中的表达与年龄的相关性，为研究白内障的发病机制及后发障的防治提供一定的理论基础。　　 实验方法：　　 一、SPARC对晶状体上皮细胞增殖、黏附、移行的影响　　 1、人晶状体上皮细胞SRA01/04的培养：　　 将SRA01/04用DMEM+10％胎牛血清接种于培养瓶中，置于5%CO2、37℃培养箱中培养，24h后换液，之后每2-3天更换一次培养液，并于倒置显微镜下观察细胞生长状态，待细胞生长至70%-80%融合时用0.25%胰蛋白酶消化，进行传代培养。　　 2、细胞增殖的检测：　　 向制成的细胞悬液中加入不同浓度的SPARC(0、0.2、1、5ug/ml)，作用24、48、72小时后，MTT法检测细胞增殖，流式细胞仪检测细胞周期及增殖指数，RT-PCR检测细胞周期调控基因CCND1、PCNA的表达。　　 3、细胞黏附的检测：　　 将SRA01/04细胞传代培养后制成密度为1×108个/L的细胞悬液，分别加入含0、0.2、1、5ug/ml SPARC，接种于涂有鼠尾蛋白的96孔板中，培养后加入MTT，酶标仪读OD值，检测细胞黏附的情况。将含有不同浓度SPARC的细胞悬液滴加到人工晶状体表面，倒置显微镜下观察细胞变化，并用血小板记数法记数人工晶状体表面黏附的细胞数。　　 4、细胞迁移的检测：　　 采用丝裂霉素划痕法检测SPARC对晶状体上皮细胞移行的影响。　　 二、热应激及氧化损伤对晶状体上皮细胞中SPARC表达的影响　　 将永生化人晶状体上皮细胞SRA01/04传代培养后分为3组：(1)正常对照组；(2)氧化损伤组：细胞中加入200×106mol/LH2O2作用6h；(3)热应激处理组：42℃30min，37℃恢复2h。细胞免疫组化法检测SPARC的表达，常规Westernblotting检测SPARC的含量。GIS-700D型凝胶图像系统扫描分析，记录平均灰度值。　　 三、SPARC在不同年龄组年龄相关性白内障患者晶状体上皮细胞中的表达　　 对照组：角膜移植术供眼6例，于晶状体赤道部剪开前囊，取出囊膜，白内障手术患者80例(分4组，<50岁组，50-65岁组，65-80岁组，>80岁组，每组20例)于超声乳化手术中环行撕囊后取直径约5mm的前囊，样品采集后立即放入-80℃低温冰箱中保存，实验前按年龄相近、性别相同的原则将4例囊膜合并成1例样本，合并后为20例。免疫印迹(Western blotting)法检测SPARC蛋白含量，GIS-700D型凝胶图像系统扫描分析，记录平均灰度值。　　 统计学处理：本研究数据均采用SPSS11.5 for windoiws软件包进行单因素方差分析，以P<0.05为有统计学意义，P<0.01有显著性差异。　　 结果：　　 一、SPARC对晶状体上皮细胞增殖、黏附、移行的影响　　 (一)SPARC对晶状体上皮细胞增殖的影响　　 1、MTT法检测细胞增殖　　 结果显示0.2ug/mlSPARC有抑制晶状体上皮细胞增殖的趋势，但无统计学意义(P>0.05)，而1ug/mlSPARC则可以明确抑制其增殖(P<0.05)，5ug/mlSPARC的抑制作用则更加显著(P<0.01)。随着作用时间的延长，抑制作用也逐渐增强。不同浓度SPARC作用72h对晶状体上皮细胞均有抑制，但0.2ug/ml组无统计学意义。5ug/mlSPARC作用72h的抑制率达68%。　　 2、流式细胞仪检测细胞周期及增殖指数　　 随着SPARC浓度的增加，S+G2/M期细胞逐渐减少，细胞停滞于G0/G1期，增殖指数逐渐下降，当SPARC浓度达5ug/ml，增殖指数下降至32.6%。　　 3、RT-PCR检测细胞周期调控基因CCND1、PCNA的表达　　 结果示微克级水平的SPARC能使细胞停滞在G0/G1期。5ug/mlSPARC作用于晶状体上皮细胞72h后，CCND1mRNA水平较对照组显著减弱，PCNAmRNA水平较对照组显著增强。　　 (二)SPARC对晶状体上皮细胞黏附的影响　　 1、SPARC与鼠尾蛋白的黏附检测　　 MTT法显示微克水平的SPARC可以明确抑制晶状体上皮细胞与胶原的黏附，并与浓度成正相关(P<0.05)。　　 2、SPARC对晶状体上皮细胞在人工晶状体表面黏附的影响　　 倒置显微镜下可见相对于对照组，实验组黏附于人工晶状体表面的细胞随着SPARC浓度的增加、作用时间的延长而逐渐稀疏、数目减少。血小板记数法记数人工晶状体表面黏附的细胞数结果显示0.2 ug/mlSPARC有抑制黏附的趋势但差异无统计学意义(P>0.05)；1ug/ml组即可见明确的抑制作用(P<0.01)；5ug/ml组作用更加明显(P=0.00)。作用1d时0.2ug/ml组未见明确改变(P>0.05)，余2组均可见细胞减少，3d、7d时各组均可见明确的抑制作用(P<0.01)。　　 (三)SPARC对晶状体上皮细胞移行的影响　　 培养72h微克水平的SPARC可以抑制晶状体上皮细胞移行，5ug/mlSPARC则有更明显的抑制作用(P<0.01)。　　 二、热应激及氧化损伤对晶状体上皮细胞中SPARC表达的影响　　 1、细胞免疫组化检测SPARC表达　　 正常对照组未见明确的荧光，热应激、氧化损伤组均可见明确的荧光反应。　　 2、免疫印记(Western blotting)法检测SPARC蛋白含量　　 对照组43Kd处未见明确条带，氧化损伤组、热应激处理组均可见SPARC表达上调。　　 三、SPARC在不同年龄组年龄相关性白内障患者晶状体上皮细胞中的表达　　 Western blotting结果显示，对照组(即正常人)43Kd处未见明确条带，实验4组均可见有明确的SPARC表达(P均<0.05)，并可见随着年龄的增长，SPARC表达增强。实验4组中，80岁以上组较其它3组SPARC表达明显增高(P均<0.01)，65-80岁组较65岁以下2组SPARC表达增高(P均<0.01)，50-65岁组较50岁组表达有增高的趋势，但无统计学意义(P=0.055)。　　 结论：　　 1、微克水平的外源性SPARC对晶状体上皮细胞增殖、黏附、移行具有明确的抑制作用。SPARC能够抑制晶状体上皮细胞增殖，使细胞停滞于G0/G1期，增殖指数下降，并使细胞周期调控基因CCND1mRNA表达减弱，PCNAmRNA表达增强。　　 2、外源性SPARC能够抑制晶状体上皮细胞在人工晶状体表面的黏附，抑制作用随浓度的增加及作用时间延长而增强。　　 3、氧化损伤、热应激可使晶状体上皮细胞中SPARC的表达上调。　　 4、相对于正常人，SPARC在白内障患者晶状体上皮中的表达上调，并有随着患者年龄增长，表达逐渐增强的趋势。