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黄瓜花叶病毒(Cucumbermosaicvirus,CMV)2b蛋白是由其基因组RNA2的亚基因组RNA4A在寄主体内表达产生,扮演致病因子、RNA沉默抑制子和病毒长距离移动决定因子的角色。2b蛋白致病性的体现几乎停留在寄主表观症状的描述,未曾从内在特征对其致病性进行深入分析。为此,本论文首先从寄主叶绿体结构和光合特征的角度探索2b蛋白的致病性。通过构建2b蛋白不表达的突变体Fny-CMV△2bpro,并与其野生病毒Fny-CMV进行平行比较,结果显示:Fny-CMV侵染的心叶烟(Nicotianaglutinosa)植株表现重花叶、畸形和矮化症状,植株的光合速率和叶绿素含量显著降低,叶绿体形态和结构发生明显病变。但是,Fny-CMV△2bpro侵染的心叶烟植株在系统叶上仅表现轻微花叶或不明显症状;与健康对照相比,其光合速率和叶绿素含量没有显著差异,叶绿体形态和结构亦未出现明显病变。由此可见,2b蛋白的表达导致叶绿体形态和结构的破坏、光合速率的降低和叶绿素含量的下降。
CMV亚组IA株系或亚组II株系编码产生的2b蛋白均表明为病毒的致病决定因子。在此,我们对CMV亚组IB株系编码的2b基因的致病性进行分析。将CMV亚组IV分离物Cb7-CMV、Na-CMV、Rad35-CMV和PGs-CMV的2bORF精确替换Fny-CMV的2bORF,分别产生以Fny-CMV作为遗传背景的4株2b基因种内杂交病毒FCb72b-CMV、FNa2b-CMV、FRad352b-CMV和FPGs2b-CMV。生物学实验结果表明:FCb72b-CMV与其亲本病毒Cb7-CMV在测试的心叶烟、普通烟(Nicotianatabacum)和本生烟(Nicotianabenthamiana)上有着相似的生物学表型,比Fny-CMV表现更强的致病性;FNa2b-CMV在这些测试寄主上也表现高致病性,相同于其亲本病毒Fny-CMV和Na-CMV;然而,FRad352b-CMV仅引起轻花叶或不明显症状,其致病性远低于其亲本病毒Fny-CMV和Rad35-CMV;FPGs2b-CMV能系统侵染以上3种烟草测试寄主,产生花叶或不明显症状,这说明PGs-CMV分离物不能系统侵染烟草寄主不是由其2b蛋白引起。通过间接方法确定种内杂交病毒的不同致病性是由其编码的2b蛋白引起,而非2a蛋白的C端重叠部分;并且,致病性高低与病毒子代RNA在系统叶中的积累水平相关,与病毒在寄主体内的长距离移动速率无关。
在以上研究结果的基础上,通过Fny-CMV与FPGs2b-CMV、Fny-CMV与FNa2b-CMV、FRad352b-CMV与FPGs2b-CMV三对组合按照不同的比例在心叶烟体内进行竞争,分析编码不同2b基因的病毒的适应性选择。结果显示:FNa2b-CMV和Fny-CMV二者在心叶烟寄主体内有着同等的适应性;Fny-CMV在心叶烟上比FPGs2b-CMV具有绝对的适应性优势;然而,FPGs2b-CMV与FRad352b-CMV相比,在心叶烟体内占据相对的适应性优势。以上结果说明病毒在寄主体内的适应性与2b蛋白介导的致病性有关。FPGs2b-CMV和Fny-CMV△2bpro二者在心叶烟体内的竞争说明了Fny-CMV和FPGs2b-CMV的适应性差异是由它们的2b蛋白引起,而非2b核苷酸序列或2a蛋白导致。
最后,我们从单细胞复制水平和细胞间扩散速率两个方面分析Fny-CMV和FPGs2b-CMV之间的差异。我们发现Fny-CMV和FPGs2b-CMV二者在心叶烟原生质体内有着同等的复制水平;但是,Fny-CMV在心叶烟接种叶上的细胞间扩散速率显著高于FPGs2b-CMV。当FPGs2b-CMV和Fny-CMV△2bpro共侵染时,前者则具有细胞间扩散的优势。以上结果说明由2b蛋白介导差异致病性的病毒之间的适应性差异与病毒在细胞间的扩散速率有关。