灌浆结实期高温是当前影响稻米品质的重要环境因素,因此研究高温条件下稻米淀粉形成过程的调控机制是培育具有稳定优质性状的水稻品种的一个重要研究方向。蜡质基因(Waxy,Wx)是控制稻米直链淀粉含量的关键基因,在栽培稻中存在多个重要的复等位基因,因此是稻米品质改良的重要选择位点。Wx基因表达易受温度等环境因素的影响,是影响稻米品质的重要因素。本研究利用课题组前期创建的携带不同Wx等位基因(Wxlv,Wxa,Wxb和wx)的近等基因系水稻为试验材料,在灌浆结实期进行高温处理,系统分析了高温对不同Wx等位基因表达及直链淀粉含量等稻米品质的影响,从转录水平和翻译水平展开了相关分子机制的探究,并在Wx基因可变剪切调控、蛋白磷酸化调控及淀粉底物结合能力方面取得一定进展。取得的主要研究结果如下:1.灌浆结实期高温对稻米外观、灌浆和直链淀粉含量等理化品质产生显著的影响。高温降低籽粒的充实灌浆程度及千粒重,增加种子的垩白度、粘滞性和糊化温度。含Wxa等位基因的NPB-Wxa水稻籽粒中直链淀粉的合成对高温胁迫表现出一定的钝性,而含有Wxlv和Wxb等位基因的NPB-Wxlv和NPB-Wxb水稻籽粒中直链淀粉含量在高温胁迫时表现为极显著地降低,其中NPB-Wxlv水稻籽粒中直链淀粉受高温抑制的程度最为显著。2.直链淀粉直接是由Wx基因编码的GBSSI蛋白所催化合成,不同Wx等位基因的转录、蛋白翻译及酶活性对高温响应与各自控制的直链淀粉含量响应高温的趋势相一致。从整个灌浆期看,Wxlv和Wxa基因的表达量要显著高于Wxb;Wxlv的转录水平在灌浆各时期均比较稳定,而Wxa的转录水平在花后15天出现了极为显著的峰值;转录水平较低的Wxb基因在花后20天才能达到峰值。受高温影响Wx1v和Wxb基因在各灌浆期的转录水平均呈现下降的趋势,其中Wx1v的表达量在花后15天受高温的影响程度最大;Wxa基因的转录水平在灌浆前期(花后15天前)受高温影响略有下降,而在灌浆后期(花后20天后)Wxa基因的表达则受高温诱导上调。GBSSI蛋白的表达水平以及灌浆各时期GBSSI的酶活性与不同Wx等位基因转录响应高温的趋势基本一致。3.通过对不同Wx近等基因系Wx基因的启动子进行比较测序分析发现Wxlv和Wxa转录起始位点ATG上游2.7 kb的启动子序列完全一致,因此Wxlv和Wxa基因表达响应高温的差异可能与该基因启动子区转录调控无关。Wxlv和Wxa基因序列仅有10号外显子上的一个SNP(SNP10C/T)差异,考虑到可变剪切是Wx等淀粉合成基因表达的重要调控方式,本研究进一步聚焦Wxlv和Wxa的可变剪切调控。通过对不同温度条件下花后10天(高温处理5天)的NPB-Wxlv和NPB-Wxa籽粒进行转录组测序分析,利用Cufflink软件对测序片段进行拼接和验算,预测出不同Wx等位基因可能存在的可变剪切模式。通过RT-PCR验证发现,NPB-Wxlv水稻经过高温处理后会产生一个内含子滞留的新转录本,这种可变剪切类型在同为粳稻背景的WY8-Wxlv水稻高温处理的籽粒中可以被检测到。此外,含有此种可变剪切类型的水稻势必伴随着GBSSI翻译水平以及直链淀粉含量的降低等表型。因此,推测可变剪切调控是Wxlv基因表达及其控制的直链淀粉合成响应高温的一种重要调控模式,而SNP10C/T是影响可变剪切发生的根本原因。此外,通过对不同温度条件下花后10天(高温处理5天)的NPB-Wxlv和NPB-Wxa籽粒进行重亚硫酸盐甲基化测序发现,高温条件下Wxlv基因第10号外显子附近的DNA区段受甲基化的程度明显高于常温条件,而Wxa基因在高温处理前后该区段的甲基化程度并无显著差异,由此可以判断SNP10C/T是影响Wxlv和Wxa基因高温条件下甲基化差异的根本原因。4.鉴于蛋白磷酸化在GBSSI蛋白稳定性和酶活性中的作用,本研究进一步分析了SNP10C/T位点对GBSSI蛋白的高温稳定性及淀粉结合能力的影响。通过原核表达系统体外表达了Wxa和Wxlv型的GBSSI蛋白,并分析了不同磷酸化程度的两种蛋白在高温条件下的稳定性。结果显示,Wxa型的GBSSI蛋白的高温稳定性显著高于Wxlv型。去磷酸化处理不会影响Wxlv型GBSSI的高温稳定性,但是会导致Wxa型的GBSSI高温稳定性极显著降低。此外,分析了外源Wxlv和Wxa型GBSSI蛋白对淀粉的结合能力,结果表明,Wxlv型原核表达GBSSI蛋白与淀粉的结合能力强于Wxa型原核表达蛋白。