前交叉韧带（anterior cruciate ligament,ACL）是膝关节重要的关节囊内韧带，对膝关节正常的运动和稳定有着十分重要的作用。ACL损伤后其非常低的愈合能力导致了大部分的病人都需要ACL移植重建手术，而目前临床使用移植物来源局限、数量紧缺且存在各种各样缺点，是ACL损伤治疗所面临的棘手问题。近几年来，随着组织工程学的迅猛发展，通过制备组织工程韧带来治疗ACL损伤修复已成为一个新的研究方向。本实验中，我们联合应用生长因子诱导骨髓间充质干细胞（Mesenchymal stem cells，MSC）定向分化为韧带样细胞并促其分泌胶原蛋白，再把诱导后的MSC移植附着于脱细胞真皮支架（Acellular dermal matrix，ADM）进一步培养，构建组织工程韧带。因而需要探讨转化生长因子β1（Transforming growthfactor-β1，TGF-β1）和碱性成纤维细胞生长因子（Basic fibroblast growthfactor，bFGF）作为在组织工程韧带技术中刺激诱导种子细胞的可行性。实验思路及目的：提取并体外培养幼兔的MSC。取第三代兔MSC，用BrdU进行荧光标记，然后使用生长因子TGF-β1和bFGF诱导MSC，使其转化为韧带样细胞，把这种诱导后的标记细胞复合于ADM上，使其良好生长、增殖、分泌胶原蛋白。实验中，探索研究生长因子TGF-β1和bFGF联合使用对MSC体外培养及在ADM上生长、繁殖、细胞功能表达的作用和影响，探讨GF联合使用作为在组织工程韧带技术中刺激诱导种子细胞定向分化的可行性。实验方法：1.MSC种子细胞的培养和诱导从幼兔四肢骨抽取骨髓分离纯化骨髓间充质干细胞并培养、增殖。取第三代兔MSC，采用10μg/L TGF-β1和25μg/LbFGF对MSC进行诱导刺激分化。实验分为空白对照组，单一因子组：TGF-β1组、bFGF组，多因子复合组：TGF-β1+bFGF组。观察生长因子对骨髓间质干细胞形态、生长、繁殖的影响。使用显微镜下观察、CCK-8实验、MTT实验检测生长因子对MSC生物活性状况的影响。2.诱导后MSC胶原染色、量化分析同样取第三代兔MSC，采用10μg/L TGF-β1和25μg/LbFGF对MSC细胞进行诱导刺激分化。实验分为空白对照组，单一因子组：TGF-β1组、bFGF组，多因子复合组：TGF-β1+bFGF组，方法同实验一。使用天狼腥红染色，采用倒置显微镜下观察和Image-Pro Plus定量检测，对比四组MSC分泌胶原蛋白变化情况。3.脱细胞真皮基质上MSC细胞BrdU免疫组化荧光染色取第三代兔MSC，用BrdU进行标记，计算BrdU标记率。然后实验分两组：空白对照组、TGF-β1+bFGF组。一方面，进行MSC细胞爬片观察两组细胞生长增殖情况；另一方面，把两组MSC移植附着于ADM上，并使其良好生长增殖。通过BrdU荧光标记，观察细胞在ADM支架材料上增殖、运动、分布情况。实验结果：实验一和实验二分别从细胞的增殖、细胞分泌胶原蛋白两个方面说明TGF-β1+bFGF联合组为最优组：TGF-β1+bFGF组MSC细胞形态优于空白组及单一因子组，细胞增殖率、胶原分泌量也最高，且细胞呈分层交叉结构排列。实验三：诱导后的MSC在脱细胞真皮材料上生长增殖良好，TGF-β1+bFGF组对比空白对照组，细胞增殖贯穿于整个支架材料层，且分布更为均匀。通过软件Imagepro-Plus测量统计，荧光单位面积比值，空白对照组：37.11±7.8%；TGF-β1+bFGF组：76.81±3.9%。结果显示后者生长因子联合作用组明显优于空白对照组。实验结论：本实验提示联合使用生长因子转化生长因子β1和碱性成纤维细胞生长因子刺激诱导兔骨髓间质干细胞，能够促使兔骨髓间质干细胞定向转化为韧带样细胞，并能在脱细胞真皮支架材料上良好生长增殖。研究表明生长因子TGF-β1和bFGF联合使用在组织工程韧带制备中十分必要，这对组织工程前交叉韧带的构建并深入探索研究具有十分积极的意义。