研究背景乳腺癌是女性恶性肿瘤中最常见的一种,肿瘤细胞的转移是乳腺癌患者治疗失败和死亡的主要原因,因此深入研究乳腺癌转移的机制无疑是需要迫切解决的一大难题。钠氢交换蛋白1(Na+/H+exchanger 1, NHE1)是在哺乳动物中广泛表达的一种整合膜蛋白,它通过交换细胞内的氢离子和细胞外的钠离子来调节细胞内外的pH,从而在许多生理和病理过程中都起着至关重要的作用。大量研究已经证实NHE1参与了许多实体瘤的转移,其中包括乳腺癌,但是其详细作用机制尚不清楚。膜型基质金属蛋白酶1(Membrane type matrix metalloproteinasesl, MT1-MMP)是基质金属蛋白酶(MMP)家族中研究较多的一个成员,它可以通过降解细胞外基质(ECM)成分、细胞粘附分子和激活MMP-2和MMP-13,从而参与细胞的迁移过程。研究表明MT1-MMP在许多恶性肿瘤中表达上调,并且有文献报道MT1-MMP在乳腺癌转移中发挥重要作用。最近的研究发现,NHE1可以通过调节一些蛋白酶的活性调控肿瘤细胞的侵袭,例如：cathepsin B、MMP9和MMP2,但是NHE1是否对MT1-MMP有调节作用尚未见有报道。目的阐明NHE1在乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞的体外迁移和侵袭中的作用,并初步探讨其作用机制,为寻找乳腺癌新的治疗策略提供理论依据。方法1.不同浓度的NHE1特异性抑制剂Cariporide处理MDA-MB-231细胞24小时,采用MTT法检测Cariporide对细胞活力的影响,从而确定本实验中Cariporide的使用浓度。2.采用划痕实验和体外侵袭实验分别观察Cariporide对MDA-MB-231细胞体外迁移能力和侵袭力的影响。3.分别采用酶谱法、实时定量PCR和免疫印迹法检测Cariporide对MDA-MB-231细胞中MT1-MMP的活性及其mRNA和蛋白水平表达的影响。4.利用分子克隆技术构建MT1-EGFP质粒,并稳定转染MDA-MB-231细胞,使其高表达MT1-MMP。采用划痕实验和体外侵袭实验分别观察高表达MTI-MMP的MDA-MB-231细胞及其用Cariporide处理后的体外迁移能力和侵袭力的变化。5.采用免疫印迹法检测：p38MAPK、ERK1/2和JNK在MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞中基础磷酸化水平的差异；MDA-MB-231细胞中,Cariporide对p38MAPK、ERK1/2和JNK信号通路的影响。6.应用体外侵袭实验和免疫印迹法分别检测用Cariporide、MAPK抑制剂(MEK抑制剂PD98059、p38 MAPK抑制剂SB203580和JNK抑制剂SP600125)及联合使用Cariporide和MAPK抑制剂处理MDA-MB-231细胞后,其体外侵袭力及MT1-MMP蛋白表达的改变。结果1,MTT结果显示,当Cariporide浓度大于或等于60μM时可明显抑制MDA-MB-231细胞的细胞活力,且呈浓度依赖性。当Cariporide浓度小于60μM时MDA-MB-231细胞的细胞活力并不受影响。本实验选用的Cariporide浓度为20gM。2.划痕实验和体外侵袭实验结果显示,Cariporide处理MDA-MB-231细胞24小时后,其体外迁移能力和侵袭力均显著降低,具有统计学意义。3.酶谱法结果显示Cariporide处理MDA-MB-231细胞后, pro-MMP2活化为MMP2的量明显减少,反映了MT1-MMP活性的降低：实时定量PCR和免疫印迹法结果显示Cariporide可分别在mRNA和蛋白水平上降低MT1-MMP的表达,且具有统计学意义。4.划痕实验和体外侵袭实验结果显示,与未作任何处理的MDA-MB-231细胞相比,过表达MT1-MMP的MDA-MB-231细胞的体外迁移能力和侵袭力均明显增强。另外,当用Cariporide处理过表达MT1-MMP的MDA-MB-231细胞后,增强的体外迁移能力和侵袭力均被减弱。差异均具有统计学意义。5.对比MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞发现,MDA-MB-231细胞中p38 MAPK和ERK1/2的基础磷酸化水平明显较MCF-7中高,且具有统计学意义；但是JNK的磷酸化水平在这两种细胞中无统计学差异。6.免疫印迹法结果显示,Cariporide处理MDA-MB-231细胞后,p38 MAPK和ERK1/2的磷酸化水平呈时间依赖性降低,具有统计学的意义,但是JNK的磷酸化水平不受影响。7.单独使用Cariporide和MAPK抑制剂(MEK抑制剂PD98059、p38 MAPK抑制剂SB203580和JNK抑制剂SP600125)处理MDA-MB-231细胞时,体外侵袭实验和免疫印迹法结果显示,MDA-MB-231细胞的体外侵袭力及MT1-MMP蛋白表达均明显下降,具有统计学的意义；当联合使用Cariporide和MAPK抑制剂处理MDA-MB-231细胞时,Cariporide可以分别和PD98059、SB203580协同性地抑制MDA-MB-231细胞的体外侵袭力及MT1-MMP蛋白的表达,然而Cariporide和SP600125之间不存在协同性。结论1.NHE1介导MDA-MB-231细胞的体外侵袭和迁移。2.NHE1通过调节MT1-MMP的表达和活性介导MDA-MB-231细胞的体外侵袭和迁移。3.NHE1对MDA-MB-231细胞的体外侵袭和MT1-MMP的调控依赖于p38 MAPK和ERK1/2信号转导通路。