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胃癌是临床常见、高发的严重威胁人类生命安全的消化道恶性肿瘤,其缺乏特异性、敏感性早期筛查指标是胃癌早期诊断中最重要的影响因素,导致大部分胃癌患者临床确诊时就已经处于中晚期,最终导致临床治疗效果及预后的不佳。因此加强胃癌发生发展病理学及分子机制研究显得尤其重要。胃癌病情发生发展的过程涉及到多种因素的共同作用。其中微小RNA(miRNA)是临床研究的热点。mi RNA特异性地与mRNA有效结合,从而通过降解或抑制的方式,调控基因表达,进而影响到肿瘤细胞的发生、生长、分化和凋亡等生物学功能。研究证实,miR-214参与肝癌、卵巢癌、结肠癌、恶性黑色素瘤、儿童骨肉瘤等恶性肿瘤的发生发展过程,且与肿瘤细胞的侵袭转移密切相关。这些研究结果显示miR-214在肿瘤中的作用是具有细胞特异性的,在不同癌症患者组织中呈现出高表达或低表达,其作用分子机制的靶向基因或抑癌症基因也有所不同。然而mi R-214在胃癌患者癌组织中的表达情况却少见报道,且miR-214在胃癌发生发展中的作用机制仍未阐明。鉴于此,本课题分两个部分对miR-214在胃癌发生发展中的作用及分子机制展开研究。首先研究人胃癌组织和非肿瘤胃粘膜组织中miR-214表达情况,分析miR-214表达的临床意义,进行miR-214的胃癌细胞功能学实验,以鉴定mi R-214的靶基因。其次采用染色质免疫共沉淀法链接miR-214的CREB1靶向基因,探讨miR-214链接CREB1靶向基因在胃癌中的功能及作用机制,为胃癌临床诊治提供理论基础。第一部分:miR-214在胃癌细胞中的表达及生物学行为研究研究目的:(1)研究胃癌患者肿瘤组织及胃癌细胞中miR-214的表达情况;(2)分析miR-214表达在胃癌发生发展中的临床意义;(3)分析miR-214表达对胃癌细胞增殖、浸润、转移、凋亡等生物学行为的影响;(4)判断miR-214表达的直接靶基因。研究方法:(1)采用实时定量PCR检测法,检测胃癌组织标本(97例)、非肿瘤胃粘膜组织标本(47例)、典型人胃癌细胞株(MKN-28、MKN-45、SGC-7901、BGC-823)及胃粘膜上皮细胞株GES-1中miR-214表达差异。(2)分析miR-214表达与胃癌患者临床病理指标及预后的关系,ROC曲线检验miR-214表达在胃癌诊断中的价值。(3)进行miR-214慢病毒过表达载体及miR-214抑制剂转染,采用实时定量PCR检测法检测转染后的miR-214表达情况,并通过EdU细胞増殖实验、细胞凋亡实验及细胞迁移浸润实验,分析miR-214表达对胃癌细胞增殖、浸润、转移、凋亡等生物学行为的影响。(4)采用Target Scan预测法鉴别mi R-214的潜在靶基因,通过靶基因3’-UTR荧光素酶载体的构建实验及Western blot实验,判断miR-214调控的靶基因。实验结果:(1)胃癌组织标本miR-214表达量约为非肿瘤胃粘膜组织标本miR-214表达量的1/6,人胃癌细胞株(MKN-28、MKN-45、SGC-7901、BGC-823)miR-214表达低于人胃上皮细胞株GES-1的miR-214表达。(2)miR-214表达可较好区分胃癌组织与非肿瘤胃粘膜组织,miR-214表达与胃癌患者肿瘤直径、淋巴结转移存在一定的相关性,但miR-214表达对胃癌患者的预后无影响。(3)miR-214高表达对胃癌细胞增殖、浸润、转移有一定的抑制作用,但对胃癌细胞的凋亡无明显影响。(4)FGFR1、CREB1、NOTCH2、AGAP2和GSF1为人胃癌细胞株mi R-214的潜在靶向基因,而CREB1为人胃癌细胞株miR-214的直接靶向基因。结论miR-214在胃癌患者肿瘤细胞中呈低表达,且在诊断胃癌组织与非肿瘤组织、鉴别胃癌肿瘤细胞有无淋巴结转移中具有一定的价值。miR-214过量表达会显著抑制胃癌肿瘤细胞的转移和侵袭,表达下调会促进胃癌肿瘤细胞的迁移和侵袭,但mi R-214对胃癌患者肿瘤细胞的凋亡功能无显著影响。miR-214在胃癌患者肿瘤细胞中的增殖、迁移、侵袭作用与调控CREB1的表达密切相关,CREB1是miR-214的直接作用靶基因,但其调控机制仍待进一步深入研究。第二部分miR-214链接CREB1靶向基因在胃癌中的细胞功能及分子机制初探研究目的:(1)观察miR-214链接CREB1靶向基因在胃癌细胞中的生物学功能(2)分析mi R-214链接CREB1靶向基因模型的启动子峰富集区域基因功能并初步分析其分子机制研究方法:(1)在胃癌细胞株CREB1基因低表达干扰质粒(siRNA,si-CREB1)和CREB1基因过表达质粒(pcDNA3.1(+)CREB1)后,进行EdU细胞増殖实验、细胞凋亡实验及细胞迁移浸润实验验,验证miR-214表达对胃癌细胞增殖、侵润、转移、凋亡等生物学行为的影响。(2)采用染色质免疫共沉淀测序技术,确定胃癌细胞株中miR-214链接CREB1靶向基因的启动子峰富集区域,并运用Gene Ontology分析法分析其功能,最后采用Pathway分析法确定其基因功能的生物学通路。实验结果:(1)miR-214链接CREB1靶向基因后可增强胃癌细胞组织的増殖、迁移和浸润能力。(2)转录失调、泛素蛋白水解、细胞自噬、ErbB信号通路激活、PI3K-Akt通路激活等分子机制可能是miR-214链接CREB1靶向基因后发挥生物学效应的途径。结论:miR-214链接CREB1靶向基因后可增强胃癌细胞组织的増殖、迁移和浸润能力。首次采用染色质免疫共沉淀测序技术鉴定了miR-214链接CREB1靶向基因后胃癌细胞株的全基因组结合谱,且初步预测转录失调、泛素蛋白水解、细胞自噬、ErbB信号通路激活、PI3K-Akt通路激活等分子机制是miR-214链接CREB1靶向基因后发挥生物学效应的途径,进而对胃癌发生发展起到调控作用的分子机制,这可为胃癌表观遗传学研究提供参考。