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蛋白质作为重要的生物大分子,是生命的物质基础之一。许多蛋白在生命过程中受到力学作用,因此研究蛋白质的力学性质将有助于我们更加深入地理解此类蛋白质的结构和功能。基于原子力显微镜（atomic force microscopy,AFM）的单分子力谱技术（single-molecule force spectroscopy,SMFS）能够在单分子层次以原子级分辨率对样品进行探测。捕获单个样品分子后,AFM-SMFS可对其施加外力进行力学操纵,可使单个蛋白质分子受力拉伸发生解折叠或者令互相结合的蛋白复合物发生解离,并测量出相应的力学强度。因此AFM-SMFS是近年来研究蛋白质力学的一种重要的实验工具和纳米技术。为保证力谱实验得到的单分子信号的真实性和高采样率,研究者一般会构建以多聚形式存在的蛋白样品（polyprotein）,并将其稳定地固定在实验体系中用于研究。因此构建适合于AFM-SMFS研究的多聚蛋白样品及其稳定固定,一直是单分子力谱领域中重要的研究方向,目前仍然是一个挑战,受到广泛地关注。在本论文中,我们采用一种高效的天冬酰胺内肽酶OaAEP1（Oldenlandia affinis asparaginyl endopeptidase）,将其作为蛋白连接酶应用于多聚蛋白的构建和固定并取得了成功,该方法实现了高效可控地制备蛋白五聚体,并通过共价键将其稳定地固定在实验体系中,极大地提高了单分子力谱实验的可信度和效率,拓展了可检测的蛋白体系。第一章中,我们首先简要介绍了原子力显微镜的工作原理及其作为单分子力谱技术在蛋白质力学研究中的应用。然后介绍了单分子力谱实验构建多聚蛋白的目的并总结了经典的多聚蛋白构建和固定化的方法。最后介绍了一些常见的蛋白连接酶和切割酶,特别是本论文使用的天冬酰胺内肽酶等。第二章中,我们构建了N-C两端为OaAEP1酶识别位点的目标蛋白模块,即GL-POI-NGL（POI:protein of interest）。首先探究了不同反应条件对酶连反应的影响（反应酶浓度、反应时长、p H和金属离子）,验证了OaAEP1酶能够少量高效地催化蛋白的连接反应,并且可耐受较宽的p H范围和多种金属离子。我们分别制备了泛素蛋白（ubiquitin,Ub）和金属红素氧还蛋白（rubredoxin,Rd）的多聚体,并进行单分子力谱检测,证明酶连反应不影响单个蛋白模块的机械力学稳定性。另外,对金属蛋白Rd的研究还体现出该酶连反应用于金属蛋白的优点。相对以往的半胱氨酸二聚交联产生聚合蛋白的方法,该酶法不会引入可能干扰蛋白结合金属的半胱氨酸,更适合于含金属等复杂蛋白体系的构建和单分子研究。第三章中,在利用化学修饰和OaAEP1酶连反应相结合固定多聚蛋白的策略基础上,我们通过引入具有强相互作用的配体-受体蛋白复合物Coh/XDoc和不产生解折叠力信号的类弹性蛋白ELP（elastin-like polypeptide）,成功实现了蛋白分子在力谱体系中的特异性固定和高效测量。该方法极大地提高了力谱实验中测量得到的多聚蛋白信号的完整度。和以往非特异性吸附的AFM实验相比,新方法的效率提高了约50倍。第四章中,我们通过联用OaAEP1酶连反应和烟草蚀刻蛋白酶（tobacco etch virus protease,TEV）的酶切反应,实现了准确控制多聚蛋白的聚合度以及聚合顺序。我们设计了含有两种酶识别序列的蛋白模块:ENLYFQGL-POI-NGL。当OaAEP1酶催化C端的“-NGL”与上个蛋白模块连接时,N端的“GL-”位点被ENLYFQ肽段保护而不参与反应。酶连反应完成后,N端序列ENLYFQG被TEV识别并酶切,暴露出N端的“GL-”位点,用于酶连下一个蛋白模块单元。重复这种TEV酶切/OaAEP1酶连交替循环即可完成一次单个的蛋白模块增长,实现序列控制的蛋白多聚。我们首先以Ub蛋白模块为研究对象,利用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）实验证明了TEV酶切得到的N端“GL-”位点,能够被OaAEP1识别并参与酶连,并定量出TEV酶切效率大于95%。同时发现提高蛋白模块相对于TEV酶切产物的比例,能够使酶切产物的酶连反应效率提高到75%,满足序列控制对酶反应效率的需求。最后,结合第三章表面固定化的单分子力谱策略,我们以Ub蛋白和Rd蛋白为对象,在玻璃基板上进行从单体到五聚体的多聚蛋白的构建和力谱实验（Ub1到Ub5、Rd1到Rd5、Ub和Rd交替连接至六聚体）。通过对上述聚合蛋白进行力谱解折叠实验,我们得到了多聚蛋白的聚合度和序列。实验证明在双酶联用的方法中蛋白模块添加的成功率约为80%,实现了蛋白二聚体到五聚体的准确构建。第五章中,我们开发了一种联用酶连反应和SPAAC（strain promoted azide-alkyne cycloaddition）点击化学反应实现蛋白表面固定化的新方法。解决了以往采用活化酯（N-hydroxysuccinimide ester,NHS）与马来酰亚胺基团（maleimide,Mal）进行蛋白固定的方法中有NHS基团易水解,而马来酰亚胺基团固定位置非特异等问题。我们采用荧光成像法定量比较了不同蛋白表面固定化方法的效果,并利用力谱在单分子层次上验证出新方法固定的蛋白结构和力学稳定性均保持正常。最后比较两种方法应用于力谱实验的效果,发现新方法显著提高了实验成功率（NHS方法～50%,SPAAC新方法～90%）,是一种高效稳定的蛋白表面固定方法。最后,我们总结了论文中利用酶法制备和固定适用于单分子力谱研究的聚合蛋白的特点和优势。并对该酶连反应进一步的优化和更多的应用进行了思考和展望。