研究背景食管癌(Esophageal cancer,EC)是一种常见的消化系统恶性肿瘤。在我国食管癌发病率和死亡率均居世界首位,全球范围内因该病造成的死亡患者有一半发生在我国。其死亡率占据第二位,仅次于胃癌。食管鳞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)占EC的90%以上,因此本研究主要针对ESCC进行探讨。虽然通过早期手术切除及后续的放疗、化疗等策略,可以使ESCC患者的生存率有所提高,然而这些治疗方式难以达到根治效果,且同时该类患者还伴有不同程度的区域淋巴结转移或远处转移。肿瘤的发生、发展、侵犯、转移是一个多基因、多分子及多系统共同参与的复杂的病理过程。其中肿瘤新血管的生成(angiogenesis)是重要因素之一。新生血管与肿瘤的生长、侵袭和淋巴结转移等过程紧密相关。趋化因子受体(chemokine receptor)是G蛋白偶联受体超家族的成员,是一类表达在某些特定的细胞膜表面的跨膜受体。近年来的研究表明,趋化因子通过与受体结合,参与新生血管生成,进一步影响肿瘤生成和转移。不同结构的趋化因子在血管生成中起不同作用,可以作为肿瘤治疗的新靶点。最近的研究已证实,趋化因子受体7(chemokine receptor,CCR7)在多种肿瘤细胞中存在过度表达,这提示肿瘤的发生发展、浸润和转移与CCR7有着密不可分的关系。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF),最早亦称作血管通透因子,其与内皮细胞的增殖、迁移和管腔形成密切相关。VEGF家族包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C及VEGF-D等几种同类物。酪氨酸激酶在VEGF与其受体VEGFR结合后被激活,继发一系列信号通路级联反应,随后激发肿瘤血管内皮发生增殖、迁移和新生血管管腔形成。核转录因子-κB(nuclear transcription factor Kappa B,NF-ΚB),最早是从成熟的B淋巴细胞中分离提取出来的蛋白,为真核细胞转录调节因子,存在于几乎所有的动物细胞中。NF-κB具有广泛的生物学活性,是炎性反应与肿瘤相互联系的重要分子蛋白,在炎症、代谢、人体免疫以及肿瘤的发生、发展、侵犯、转移等方面发挥着关键作用。大量研究表明,NF-κB与肿瘤有密切关系,可以通过调节各种不同靶基因,参与多种信号通路,诱导细胞抑制凋亡并促进细胞的增殖、侵袭、转移,促进肿瘤细胞血管生成、与致癌作用密切相关。目前国内外有较多的临床资料显示,CCR7的高表达与ESCC的发生、浸润及转移密切相关。但是,对于CCR7在ESCC细胞株中的表达,和ESCC血管形成中的作用,及其与NF-κB、VEGF等分子的相互作用关系目前尚不清楚。目标在本研究中,我们首先检测CCR7在ESCC细胞株中的表达,进而通过体内外实验,观察CCR7的异常表达与ESCC新生血管形成的关系,以及CCR7与VEGF、NF-κB及其下游基因的相互作用关系,再进一步探讨其中的分子机制。力图为阐释食管癌转移、复发的机制,以及基于CCR7的靶向治疗药物开发奠定基础。第一部分CCR7在ESCC中表达情况方法1、应用生物信息学技术方法回顾性整理并研究了不同报道中ESCC患者肿瘤组织中CCR7表达情况;2、应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及免疫印迹(WB)方法联合检测CCR7在多种不同种系的ESCC细胞中的表达情况。结果1、针对CCR7基因的表达情况在GEO PROFILE数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/)中进行搜索分析,结果发现ESCC中的CCR7的表达较正常组织中CCR7的水平显著提高。2、Western Blot结果显示,所有6株ESCC细胞系(TE-1,TE-2,TE-3,TE-8,TE-12和ECA-109)CCR7蛋白表达均显著高于正常食管上皮细胞株HEEC。q RT-PCR结果显示在m RNA水平上,ESCC细胞系中的CCR7表达显著高于HECC细胞。结果提示,CCR7在食管鳞状细胞癌基因及蛋白水平均具有高表达的特性。第二部分CCR7在Eca109细胞增殖、迁移和诱导新生血管形成中的作用方法1、建立CCR7稳定过表达和沉默的Eca109细胞系。2、应用MMT法检测过表达和沉默CCR7对Eca109细胞的活性影响。3、采用人脐静脉内皮细胞增殖、迁移实验和CAM实验检测CCR7表达改变对Eca109细胞增殖、迁移及诱导血管生成能力的影响。4、采用Western Blot实验检测VEGF-A和VEGF-C在CCR7过表达和沉默的Eca109细胞系中的表达情况。结果1、成功建立CCR7稳定过表达和沉默的Eca109细胞系。2、CCR7过表达Eca109细胞增殖、迁移和诱导血管生成能力显著增强;而CCR7沉默Eca109细胞上述能力显著减弱。3、CCR7过表达Eca109细胞VEGF-A和VEGF-C蛋白表达显著增高;而CCR7沉默Eca109细胞上述蛋白表达显著降低。结果提示,过表达CCR7增强Eca109细胞的细胞存活率,增加内皮细胞的迁移,增强血管形成能力,并上调VEGF-A和VEGF-C蛋白的表达,提高食管鳞癌细胞在体外诱导新血管形成能力。相反,沉默抑制CCR7表达则得到相反的结果。这些结果证实,CCR7能促进食管鳞状细胞癌的血管生成能力。第三部分CCR7对NF-k B信号通路的调节作用方法1、荧光素酶报告分析验证过表达CCR7和沉默CCR7对NF-k B通路的影响。2、通过Western blot、RT-PCR和ELISA等实验检测过表达和沉默CCR7对NF-k B信号通路的影响。结果1、CCR7蛋白的过表达能使NF-k B报告基因的转录活性增强。2、通过Wetern blotting实验结果证实ECA109中过表达CCR7能够显著提高磷酸化的IKK和磷酸化的Ik Bα的表达水平,但不能显著改变IKK和Ik Bα的总蛋白表达水平。3、Western botting实验和ELISA实验的结果显示多种NF-k B靶基因(包括TNF-α、IL-6、IL-8和TGF-β)在过表达CCR7的Eca109细胞中表达上调;而在CCR7沉默的Eca109细胞中表达下调。结果显示,过表达CCR7增强了NF-k B的报告基因的转录活性,而抑制CCR7表达则抑制了NF-k B的转录活性。CCR7的表达增加,增强了磷酸化IKK和磷酸化Ik Bα的水平,却没有显著改变IKK或Ik Bα总蛋白水平。此外,包括TNF-α,IL-6,IL-8,TGF-β在内的NF-k B相关的靶基因水平数,在上调CCR7的表达和下调细胞CCR7沉默食管癌细胞分别被上调和抑制了。表明CCR7对NF-k B信号通路起促进作用。第四部分CCR7下调对Eca109裸鼠移植瘤生长的影响及机制方法1、建立裸小鼠皮下ESCC移植瘤模型。分组注射1×107个control-si RNA和CCR7-si RNA ECA109细胞后观察肿瘤的生长。2、Western botting实验分析了肿瘤中VEGF-A、VEGF-C、TNF-α、IL-6、IL-8、TGF-β和NF-k B通路中磷酸化IKK和磷酸化Ik Bα及IKK或Ik Bα总蛋白的表达水平。结果1、下调CCR7蛋白的表达,ESCC移植瘤体积显著减小2、抑制CCR7表达后,VEGF-A、VEGF-C、TNF-α、IL-6、IL-8、TGF-β和NF-κB的蛋白表达水平显著降低,IKK和Ik Bα的磷酸化水平降低,而IKK和Ik Bα总蛋白水平无显著改变。结果提示,si RNA沉默CCR7在Eca109裸鼠移植瘤模型的抑制肿瘤疗效非常显著,其可能是通过抑制NF-k B通路来抑制ESCC细胞生长。全文结论1、CCR7在ESCC细胞中表达增高。2、通过构建稳定CCR7过表达和沉默的Eca109细胞系,明确了CCR7对Eca109肿瘤新生血管的促进作用。表明CCR7可能对ESCC的发生发展和血管生成发挥重要作用,可能作为ESCC新的治疗靶点。3、CCR7蛋白的过表达能使NF-k B报告基因的转录活性增强;CCR7能够显著提高IKK和Ik Bα的磷酸化水平;且多种NF-k B靶基因(包括TNF-α、IL-6、IL-8和TGF-β)在过表达CCR7的Eca109细胞中表达上调,而在CCR7沉默的Eca109细胞中表达下调。表明CCR7对NF-k B信号通路起促进作用。4、通过体内实验证实注射CCR7沉默组Eca109细胞裸鼠的肿瘤平均体积比对照组裸鼠明显减少。且移植瘤中VEGF-A、VEGF-C、TNF-α、IL-6、IL-8和TGF-β的蛋白表达水平显著降低,IKK和Ik Bα的磷酸化水平降低,而IKK和Ik Bα总蛋白水平无显著改变。进一步证实CCR7可能通过NF-k B信号通路对ESCC发挥促进作用。