非酒精性脂肪肝病(Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是指由遗传、环境和代谢等因素引起的,肝脂肪沉积大于肝总重量5%,表现为肝细胞脂肪变性和脂肪贮积为特征的临床病理综合征,其发病无过量饮酒史。由于NAFLD发病机制复杂,尚无理想的治疗药物,常用的二甲双胍、吡咯列酮和维生素E等只对NAFLD起到一定的辅助治疗效果,目前只能通过控制危险因素、运动疗法和调整饮食结构等方法进行预防。文蛤(Meretrix meretrix L)俗称蛤蜊,是我国重要的海洋贝类之一。文蛤肉鲜,营养丰富,含有人体必需的氨基酸、蛋白质、碳水化合物、维生素和其他重要物质。近年来研究表明文蛤有重要的药用价值,在抗肿瘤、抗氧化和抗衰老等方面表现出显著的功效,是有待开发的保健食品,而有关文蛤提取物对NAFLD模型的作用尚未见报道。本研究以文蛤为实验材料,主要借助现代的海洋生物提取分离技术和分子生物学等方法,探讨从文蛤内脏中提取的文蛤寡肽(Meretrix meretrix oligopeptides,MMO)对NAFLD模型的修复作用,研究其作用机制,实验数据为开发新的护肝保健食品奠定理论和实验基础。研究内容本研究以文蛤为实验材料,通过酶解、超滤、G-25葡聚糖凝胶层析和HPLC等方法获得MMO,以体外培养的Chang liver细胞构建NAFLD细胞模型和小鼠急性NAFLD模型为研究对象,从以下五个方面探讨MMO对NAFLD模型的修复作用。1、软脂酸处理Chang liver细胞构建NAFLD体外细胞模型,判断标准是油红O染色观察细胞内脂滴数量及肝功能相关指标。2、利用胃蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶对文蛤进行不同条件的酶解,以细胞内TG含量降低率为指标获得最佳酶种。通过设计正交试验,综合温度、酶解时间、加酶量、pH值和料液比等五因素对文蛤进行酶解,将酶解产物作用于NAFLD模型,筛选出最佳的酶解条件,然后利用超滤法、G-25葡聚糖凝胶层析技术和HPLC等对酶解液进行分离纯化,获得的纯化肽进行了氨基酸序列分析。3、将实验细胞分成4组,分别为正常changliver细胞(正常组)、nafld细胞模型(模型组)和mmo药物组,药物组作用的细胞为nafld细胞模型,mmo药物浓度分为10mg/ml(低浓度组)和20mg/ml(高浓度组)。检测4组细胞中alt、ast、γ-gt、mda和sod等指标的含量变化,并通过油红o染色观察细胞内的脂滴情况,检测细胞内线粒体能量代谢的变化情况,流式细胞仪检测线粒体膜电位和细胞早期凋亡率的变化。4、westernblot检测正常组、模型组和药物组中凋亡相关因子bax、bcl-2、caspase-9、caspase-3、tnf-α、jnk等蛋白的表达情况。5、用含有5%ccl4的花生油注射小鼠建立急性nafld模型,观察正常组、模型组、mmo药物组和联苯双酯滴丸组的小鼠肝脏形态变化,检测小鼠血清内肝功能指标的变化情况,he染色观察小鼠肝脏的组织病理学病变情况。研究结果1、以浓度为15μg/ml软脂酸诱导changliver细胞48h可以获得nafld体外细胞模型。肝功能指标检测结果显示,alt、ast、γ-gt和mda等指标随着软脂酸诱导时间增长而增加。油红o染色结果显示,正常组细胞仅可见少量脂滴,而经软脂酸诱导后,随着作用时间的延长脂滴数量明显增多。2、最佳酶种为碱性蛋白酶,酶解的最佳条件为40℃、ph为9.5、料液比为1:2、酶解时间为8h且加酶量为1000u/g,文蛤寡肽序列为gln-leu-asn-trp-asp。肝功能指标检测结果显示,药物组细胞alt、ast、γ-gt和mda等含量下降,sod含量则有所上升。3、药物组细胞内脂滴数量显著降低,且数量随着mmo药物浓度的增大逐渐减少。线粒体能量代谢检测结果显示,mmo可以显著改善细胞线粒体能量代谢受阻情况。annexinv-fitc/pi双染结果显示,模型组早期凋亡率明显高于正常组细胞,随着mmo药物浓度的增加,早期凋亡率逐渐下降;模型组较正常组细胞的线粒体膜电位下降比例高,而药物组线粒体膜电位高浓度组比低浓度组下降明显。4、westernblot结果表明,药物组bcl-2蛋白表达量明显增多,bax、caspase-9、caspase-3、jnk和tnf-α蛋白的表达量降低,bcl-2/bax比值明显升高。5、模型组小鼠肝脏呈乳白色,受损严重;经过MMO处理后,肝脏颜色变深,受损减轻。HE结果显示,模型组小鼠肝脏呈中央性坏死,肝小叶紊乱,肝索断裂,肝细胞出现大量空泡;高浓度药物组小鼠肝脏无明显坏死,肝索比较明显,空泡数量减少。肝细胞功能指标检测显示,ALT、AST、γ-GT和MDA等在高浓度药物组小鼠体内含量显著减少,而SOD含量则显著增多。研究结论1、文蛤寡肽氨基酸序列为Gln-Leu-Asn-Trp-Asp。2、MMO对NAFLD细胞模型和动物模型具有一定的修复作用,且呈现一定的剂量依赖效应。3、MMO对NAFLD细胞模型修复作用的机制可能是促进凋亡抑制基因Bcl-2的表达,抑制促凋亡基因Bax、Caspase-3和Caspase-9基因的表达,从而起到对NAFLD细胞模型的保护作用。