酒精性心肌病(Alcoholic cardiomyopathy,ACM),是一类由于长期大量饮酒所引起的特异性心肌疾病,主要以左室扩张,射血分数降低及心律失常为特征。临床病理资料显示:在酒精性心肌病心肌组织中,出现心肌细胞肿胀,糖原和脂质积聚;肌浆网和线粒体结构发生改变,心肌纤维条纹数量减少;同时还出现不同程度的间质纤维化以及由附壁血栓和肿胀的心肌细胞组成的局灶性病变。尽管酒精性心肌病的具体发病机制尚不十分清楚,但是近期的研究表明作为关键的氧化应激调节因子:肾素-血管紧张素系统(Renin-angiotensin system,RAS)在酒精性心肌病的疾病发展过程中扮演了重要的角色。除了经典的循环系统RAS外,心肌组织局部RAS也成为新的研究热点。作为局部组织RAS新成员之一,(前)肾素受体((Pro)renin receptor,PRR)因其诸多生物学功能而备受关注。(前)肾素受体通过与肾素或者前肾素(统称为:(前)肾素)相结合,一方面,可以显著提高(前)肾素的生物活性,增加血管紧张素原(Angiotensinogen,AGT)向血管紧张素Ⅰ(Angiotensin Ⅰ,Ang Ⅰ)的转化效率,进一步经由血管紧张素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ)途径发挥生物学功能;另一方面,两者相结合引起PRR的空间构象改变,通过募集胞质内转录因子早幼粒细胞白血病锌指蛋白(Promyelocytic leukemia zinc finger protein,PLZF)等,将细胞外信号转导至细胞内,后者又被称作Ang Ⅱ非依赖效应。研究报道:在扩张型心肌病患者的心内膜活检样本中,PRR基因表达水平明显上调,且与疾病的严重程度具有相关性。然而对于PRR在酒精性心肌病中的作用及机制尚未见报道。本研究主要利用动物实验及体外细胞实验,观察大鼠酒精性心肌病心肌组织PRR的表达情况,研究PRR在酒精性心肌病病理过程中的作用,进一步深入阐明PRR参与酒精性心肌病的作用机制,为酒精性心肌病的治疗提供新的靶点。我们的实验主要围绕以下三部分展开:第一部分:大鼠酒精性心肌病动物模型的构建研究背景随着社会经济的发展,物质生活的丰富,酒精类饮品的使用也日渐增多。酒精及其在体内的代谢产物乙醛等毒性物质蓄积对体内多个器官具有损伤作用,导致的健康问题日益受到人们的关注。酒精性心肌病(Alcoholic cardiomyopathy,ACM),是一类指由于长期大量饮酒导致患者出现心腔扩张、心律失常及心功能不全的心脏疾病。大量临床病理资料显示:在酒精性心肌病心肌组织中,出现心肌细胞肿胀,糖原和脂质积聚;肌浆网和线粒体结构发生改变,心肌纤维条纹数量减少;同时还出现不同程度的间质纤维化,以及由附壁血栓和肿胀的心肌细胞组成的局灶性病变。既往研究证实酒精性心肌病的病理生理机制涉及:氧化应激、细胞死亡、线粒体功能障碍及神经体液内分泌系统异常激活等多种机制,但是其具体的发病机制尚不十分详细,故临床上对于酒精性心肌病的诊治主要以流行病学观察为主,具体的治疗策略也是经验性的治疗或者对症治疗,治疗效果并不显著。在本部分实验中,我们通过给予大鼠白酒灌胃处理,模拟酒精性心肌病的形成过程,观察酒精性心肌病的主要病理损伤,研究其可能的病理机制,为酒精性心肌病的临床诊疗提供新的思路。研究目的1.通过白酒灌胃的途径构建大鼠心肌损伤模型,观察白酒摄入对大鼠心肌组织的损伤情况。2.通过对一般状态的观察,心功能的检测及心脏组织病理学的检测,评估白酒灌胃的方法对于构建大鼠酒精性心肌病模型的可行性。3.探讨酒精性心肌病心肌损伤可能的病理生理机制。研究方法1.动物模型的建立将30只Wistar大鼠(200±15g)随机分为对照组(Control组,n=15)和白酒灌胃组(Alcohol组,n==15)。对于Alcohol组中大鼠,给予白酒灌胃处理,酒精的剂量占饮食总量的9%(v/v);对于Control组中大鼠,给予相同剂量的生理盐水。8周后,大鼠血清酒精浓度达237±42mg/100mL,超声心动图提示心腔扩大,收缩功能下,视作模型构建成功。随后继续喂养4周,12周后所有大鼠麻醉后处死取材。2.心功能检测腹腔注射戊巴比妥钠(60mg/kg)麻醉所有组中的大鼠,使用VEVO770高分辨率成像系统测量所有组(Control组、Alcohol组)大鼠的血流动力学参数。在左心室长、短轴切面行二维超声、M型超声评价大鼠左心室功能,记录包括左心室射血分数(LVEF),缩短分数(FS),左心室舒张末期直径(LVEDD),左心室收缩末期直径(LVESD)等数据用于评估心脏的收缩功能;在心尖四腔心切面测量二尖瓣舒张早期血流速度(E value)和舒张晚期血流速度(A value),并计算E/A 比C值(E/Aratio)用于评估心脏舒张功能。3.心肌组织学检测动物实验结束后,各组大鼠心肌组织经4%多聚甲醛浸泡,石蜡浸润包埋,常规制备4.5μm厚度的病理切片。行常规HE染色评估心肌损伤情况,Masson染色、天狼星红染色、collagen I免疫组织化学染色评估各组大鼠心肌纤维化情况,NOX4、3-NT及4-HNE免疫组织化学染色评估大鼠心肌组织氧化应激水平,IL-1β、IL-6、TNF-α免疫组织化学染色评估大鼠心肌组织炎症水平,TUNEL染色评估大鼠心肌细胞凋亡情况。研究结果1.白酒灌胃后两组大鼠一般状态比较Control组大鼠活泼好动,毛色鲜亮光滑,手感柔顺,饮食良好,精神状态良好,抓取时抵抗明显;与Control组大鼠相比较,Alcohol组大鼠毛色晦暗无光泽,手感粗糙,饮食略有减少,精神状态欠佳,处于嗜睡状态,甚至个别大鼠偶有昏迷现象,抓取时无明显抵抗,对外界刺激无明显反应。实验结束后,称取各组大鼠体重(g),取材时称取各组大鼠心脏重量(mg),并计算各组大鼠心脏重量/体重(mg/g)的比值。结果显示:与Control组大鼠相比较,Alcohol组大鼠体重有所下降(P<0.01),两组大鼠之间心脏重量/体重(mg/g)比值也有显著统计学差异,Alcohol组大鼠该值明显增高(P<0.01),同时Alcohol组大鼠的心率也有所增加(P<0.05)。2.白酒灌胃损伤大鼠左心室功能Alcohol组中大鼠出现了不同程度的心功能损伤,LVEDD、LVESD测量值较Control组明显增大(P<0.01),胸骨旁左室长、短轴M超及心尖四腔心切面的超声显示:与Control组相比较,Alcohol组中大鼠LVEF、FS测量值有所减小(P<0.01),表明白酒灌胃引起大鼠左心室扩张,收缩功能受损;Alcohol组中大鼠的E/A 比值也有所下降(P<0.01),说明大鼠的心脏舒张功能也受到了影响,心肌顺应性下降。3.白酒灌胃加重大鼠心肌纤维的损伤Control组中大鼠心肌细胞大小正常,形态均匀,心肌纤维排列整齐,分布均匀密集,肌纤维结构清晰,间质未见其他炎性细胞浸润。与之对比,Alcohol组中大鼠心肌细胞大小不一,形态不均,可见心肌细胞水肿,部分肌纤维溶解坏死,排列紊乱,部分心肌细胞可见空泡样改变并伴有少许间质炎性细胞浸润。4.白酒灌胃加重大鼠心肌间质纤维化Control组中大鼠心肌间质可见少量散在胶原分布,与Control组相比较,Alcohol组中大鼠心肌间质胶原含量增加(P<0.01),分布更加弥散,并且血管壁周围胶原沉积尤为明显。进一步collagen Ⅰ的免疫组织化学染色结果显示:与Control组相比较,Alcohol组中大鼠心肌间质collagen Ⅰ含量增加(P<0.01),心肌间质collagen Ⅰ弥漫性增多。5.白酒灌胃加剧大鼠心肌氧化应激损伤免疫组织化学染色显示:Control组中大鼠心肌组织NOX4蛋白少量散在表达,与Control组相比较,Alcohol组中大鼠心肌组织NOX4的表达明显上升(P<0.01),同时该组大鼠心肌组织中蛋白质酪氨酸残基硝基化产物(3-Nitrotyrosine,3-NT)及脂质过氧化产物(4-Hydroxynonenal,4-HNE)表达同样增高(P<0.01)。6.白酒灌胃加重大鼠心肌炎症损伤正常情况下,心肌组织的炎症因子表达水平很低,可由少数浸润的炎性细胞分泌。免疫组织化学染色显示:与Control组相比较,Alcohol组中大鼠心肌组织炎症因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)表达水平显著上升(P<0.01)。7.白酒灌胃增加大鼠心肌细胞的凋亡实验结束TUNEL染色用于标记凋亡细胞,结合TUNEL染色阳性及细胞核皱缩等形态学特征认定为凋亡细胞,结果显示:与Control组相比较,Alcohol组中大鼠凋亡的心肌细胞数量增多(P<0.01)。研究结论1.通过白酒灌胃的途径可以成功构建大鼠酒精性心肌病损伤模型。2.大鼠酒精性心肌病心肌损伤主要涉及心肌细胞的损伤、凋亡,心肌组织氧化应激水平增加,心肌组织纤维化及炎症损伤加剧。第二部分:(前)肾素受体(PRR)对酒精性心肌病心肌重构及心功能损伤的影响及意义研究背景酒精性心肌病(Alcoholic cardiomyopathy,ACM)是一类由于长期大量饮酒所引起的特异性的心肌疾病。长期酗酒导致体内乙醇及其代谢产物乙醛等心肌毒性物质蓄积,进而出现一系列以左室扩张,射血分数降低,心律失常为特征的临床症状。众多国内外研究表明:长期大量饮酒导致心肌细胞乙酰脂肪酸堆积、线粒体功能障碍、氧化应激损伤、凋亡、心脏重构,最终演变为难治性心衰,为我们的医疗系统带来沉重的负担。尽管酒精性心肌病的具体发病机制尚不十分清楚,但是近期的研究表明作为关键的氧化应激调节因子,肾素-血管紧张素系统(Renin-angiotensin system,RAS)在酒精性心肌病的病理过程中扮演了重要的角色。与经典的循环系统RAS相比较,心肌组织局部RAS更能引起人们的研究热情。作为局部组织RAS的新成员之一,(前)肾素受体((Pro)renin receptor,PRR)因其诸多生物学功能而备受关注。(前)肾素受体通过与肾素或者前肾素(统称为:(前)肾素)相结合,一方面,可以显著提高(前)肾素的生物活性,增加血管紧张素原(Angiotensinogen,AGT)向血管紧张素Ⅰ(Angiotensin Ⅰ,Ang Ⅰ)的转化效率,进一步经由血管紧张素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ)途径发挥生物学功能。另一方面,两者相结合引起PRR的空间构象改变,通过募集胞质内转录因子早幼粒细胞白血病锌指蛋白(Promyelocytic leukemia zinc finger protein,PLZF)等,将细胞外信号转导至细胞内,后者又被称作Ang Ⅱ非依赖效应。然而对于PRR在酒精性心肌病中的作用及机制尚未见报道。因此,本部分实验基于第一部分所建立的酒精性心肌病动物模型,观察PRR基因在酒精性心肌病心肌组织中的表达情况,探讨其对心肌损伤、心室重构的影响。研究目的1.建立大鼠酒精性心肌病模型,观察PRR在酒精性心肌病大鼠心肌组织中的表达情况。2.构建PRR基因过表达及PRR基因沉默腺病毒载体,观察PRR基因过表达及PRR基因沉默对酒精性心肌病大鼠心肌重构及心功能的影响。3.探讨PRR基因对酒精性心肌病心肌重构及心功能影响的机制。研究方法1.构建大鼠PRR基因过表达及PRR基因沉默腺病毒载体根据GeneBank记录大鼠PRR基因序列,构建含有大鼠PRR基因的腺病毒过表达载体。根据基因沉默的技术原则,设计并合成3对针对大鼠PRR基因的shRNA序列,经过RRT-PCR及Western blot实验,筛选出沉默效率最高的序列,包被腺病毒沉默载体,以备后续实验。2.酒精性心肌病动物模型的建立及分组将90只Wistar大鼠(200±15g)随机分为正常对照组(Control组,n=15)和白酒灌胃组(Alcohol组,n=75只)。对于Alcohol组中大鼠,给予白酒灌胃处理,酒精的剂量占饮食总量的9%(v/v)。对于Control组中大鼠,给予相同剂量的生理盐水。8周以后Alcohol组中大鼠血清酒精浓度达237±42 mg/100mL,超声心动图显示心腔扩大,收缩功能降低,视作模型构建成功。将Alcohol组进一步分为:酒精性心肌病组(ACM组,n=15),EGFP组(EGFP组,n=15),Scramble-shRNA 组(Scr-shRNA 组,n=15),PRR 组(PRR 组,n=15),PRR-shRNA组(PRR-shRNA,n=15),相应各组大鼠经由尾静脉注射腺病毒1 ×10v·g(溶于100μL生理盐水)以表达EGFP、Scr-shRNA、PRR和PRR-shRNA,随后继续喂养4周,所有大鼠麻醉后处死取材。3.心功能检测病毒注射4周后,腹腔注射戊巴比妥钠(60mg/kg)麻醉所有组中大鼠,使用VEVO770高分辨率成像系统测量所有组中大鼠的血流动力学参数。在左心室长、短轴切面行二维超声、M型超声评价大鼠左心室功能,记录包括左心室射血分数(LVEF),缩短分数(FS),左心室舒张末期直径(LVEDD),左心室收缩末期直径(LVESD)等数据用于评估心脏收缩功能,在心尖四腔心切面测量二尖瓣舒张早期血流速度(E value)和舒张晚期血流速度(A value),并计算E/A 比值(E/A ratio)用于评估心脏舒张功能。4.心肌组织病理学检测病毒注射4周后,各组大鼠心肌组织经4%多聚甲醛浸泡,石蜡浸润包埋,常规制备4.5μm厚度的病理切片。行常规HE染色评估心肌损伤情况,Masson染色评估各组大鼠心肌间质纤维化情况,免疫组织化学染色评估各组大鼠心肌组织collagen Ⅰ、collagen Ⅲ、CTGF、NOX4 蛋白表达情况,以及炎症因子 IL-lβ、IL-6的表达水平,甲苯胺蓝染色分析肥大细胞脱颗粒情况。5.蛋白印记实验(Western blot)常规大鼠心肌组织总蛋白提取,行Western blot实验检测各组大鼠心肌组织中PRR、ERK1/2、p-ERK1/2、NOX4、TGF-β蛋白的表达水平。6.心肌组织氧化应激检测新鲜心肌组织取材完成后,立即使用OCT组织包埋剂包埋,常规冰冻切片制备。使用10μM浓度的DHE孵育组织,37℃避光,30min,荧光显微镜下观察。7.RT-PCR常规大鼠心肌组织总RNA提取,应用实时荧光定量PCR技术检测PRR的mRNA表达水平。研究结果1.随着酒精性心肌病的病程进展,心肌组织PRR的蛋白表达水平逐渐增高我们检测了不同时间点酒精性心肌病心肌组织PRR的蛋白表达情况,免疫组织化学染色结果显示:与未行白酒灌胃(Week 0)的大鼠相比,白酒灌胃4周(Week 4)时心肌组织PRR的蛋白表达水平显著上调(P<0.05),随着造模时间的继续延长,心肌组织PRR的蛋白表达水平可以维持上调至12周(Week 12)(P<0.05)。2.PRR基因介导了酒精性心肌病心肌组织中NOX4蛋白表达水平及ERK1/2蛋白磷酸化水平的增加RT-PCR及Western blot结果证实:PRR组中大鼠心肌组织PRR的mRNA表达水平及蛋白表达水平显著上升(P<0.05);而无论是PRR的mRNA表达水平还是其蛋白表达水平,PRR-shRNA组中大鼠心肌组织均有不同程度的降低(P<0.05)。同时,心肌组织HE染色结果显示:PRR组中大鼠心肌细胞横截面积比ACM组中大鼠心肌细胞横截面积大(P<0.05),而ACM组和EGFP组之间没有统计学差异(P=0.987);PRR-shRNA组中大鼠的心肌细胞横截面积有所减小(P<0.05)。Western blot结果显示:与ACM组中大鼠相比较,PRR组中大鼠心肌组织匀浆中NOX4蛋白表达及ERK1/2蛋白的磷酸化水平显著上升(P<0.05),而PRR-shRNA组中大鼠心肌组织匀浆中NOX4蛋白表达及ERK1/2蛋白的磷酸化水平均有所降低(P<0.05)。3.PRR基因介导了酒精性心肌病心功能的损伤经胸超声心动图检测显示:与Control组中大鼠相比较,ACM组中大鼠出现明显的心腔扩张并伴有心功能的减退(P<0.05)。与ACM组中大鼠相比,PRR组中大鼠的LVESD和LVEDD进一步增大(P<0.05),同时该组大鼠的LVEF和FS也有不同程度的降低(P<0.05),尽管PRR-shRNA组中大鼠的LVEF和FS有所增加(P<0.05),LVESD有所减小(P<0.05),但是就E/A 比值而言,PRR-shRNA组和ACM组之间没有明显的统计学差异(P=0.460)。4.PRR基因介导了酒精性心肌病心肌纤维化的进程Masson染色结果显示:与Control组中大鼠相比,ACM组中大鼠心肌间质胶原纤维沉积明显增多(P<0.05);与ACM组中大鼠相比,PRR基因过表达可进一步增加间质胶原的沉积(P<0.05),而PRR基因沉默可以减少ACM心肌组织中胶原纤维的沉积(P<0.05)。免疫组织化学染色结果显示:与ACM组中大鼠相比,PRR基因过表达可同时增加心肌间质 collagen Ⅰ、collagen Ⅲ、CTGF 和 fibronectin 的表达(P<0.05),而PRR基因沉默则可以减少ACM心肌组织中这些纤维化因子的表达(P<0.05)。5.PRR基因介导了酒精性心肌病心肌组织氧化应激损伤与Control组中大鼠的心肌组织相比,ACM组中大鼠心肌组织DHE染色阳性的荧光斑点较为密集,荧光强度有所增强(P<0.05);与ACM组相比,PRR组中大鼠心肌组织DHE染色阳性的荧光斑点更为密集,荧光强度更强(P<0.05),而PRR基因沉默可以减弱ACM心肌组织DHE染色阳性的荧光斑点密集程度及强度(P<0.05)。免疫组织化学染色结果显示:与Control组中大鼠相比,ACM组中大鼠心肌组织3-NT、4-HNE及NOX4蛋白的表达水平显著上升(P<0.05),PRR基因过表达可进一步增加大鼠心肌组织3-NT、4-HNE及NOX4蛋白的表达水平(^0.05);而PRR基因沉默则可以降低ACM心肌组织中3-NT、4-HNE及NOX4蛋白的表达水平(P<0.05)。6.PRR基因介导了酒精性心肌病心肌组织炎症损伤甲苯胺蓝染色结果显示:与Control组中大鼠相比,ACM组中大鼠心肌组织发生脱颗粒反应的肥大细胞数量明显增多(P<0.05),同时ACM组中大鼠心肌组织炎症蛋白:IL-1β和IL-6的表达也有所增高(P<0.05);PRR基因过表达可进一步增加ACM心肌组织中发生脱颗粒反应的肥大细胞数量(P<0.05),同时上调炎症蛋白IL-1β和IL-6的表达(P<0.05);与ACM组中大鼠相比较,无论是发生脱颗粒反应的肥大细胞数量还是IL-1β和IL-6等炎症因子的表达均可以被PRR基因沉默所改善(P<0.05)。研究结论1.酒精性心肌病心肌组织中PRR基因表达水平显著上升。2.PRR基因通过介导心肌组织氧化应激损伤,加重心肌纤维化及炎性损伤,加重酒精性心肌病心肌重构及心功能损伤。第三部分:(前)肾素受体(PRR)在成纤维细胞酒精刺激损伤中的作用及机制研究研究背景酒精性心肌病(Alcoholic cardiomyopathy,ACM)是一类由于长期大量饮酒所引起的心肌特异性病变,体内蓄积的乙醇及其主要代谢产物乙醛可引起心肌细胞的肥大、凋亡及心脏纤维化,其中心脏纤维化是导致心肌重构及心力衰竭发生的重要病理基础。心脏成纤维细胞的主要功能之一就是负责细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)的产生及代谢稳态,为心脏功能的发挥提供一个稳定的三维空间网络。但是在多种致病因子的作用下,大量心脏成纤维细胞积聚激活转化成肌成纤维细胞,产生过多的ECM沉积,参与心肌重塑及心功能的损伤。自从肾素(Renin)被首次命名以来,关于肾素-血管紧张素系统(Renin-angiotensin system,RAS)的研究已经持续了百余年。随着研究的不断深入,新的问题不断出现,同时又会有新的成员加入,逐渐地我们把RAS分为两部分相对独立却又相互影响的系统:循环系统RAS和局部组织RAS。前者主要在体液代谢、水电解质平衡及血压稳态等方面发挥重要作用,后者则在细胞生长、增殖、蛋白合成以及器官损伤等局部组织效应中发挥重要作用。之所以被称作相对独立,是因为后者可以独立于前者执行其功能;更有甚者局部组织间隙液中RAS组分含量要远比循环系统RAS组分的含量高很多倍。那么到底是何原因引起组织间质液RAS组分浓度与循环系统中RAS组分浓度的差距呢?这个问题一直困惑着众多研究人员。直到2002年,Nguyen等人首次报道并克隆出人的肾素/肾素前体受体(Renin/proreninreceptor,PRR)才为我们解释这一问题提供了新的思路。多项研究报道:PRR广泛分布于机体的多种细胞中,在小鼠肾脏集合管细胞中,PRR通过MAPK-ROS途径,上调CTGF、PAI-1等纤维蛋白的表达,增加肾脏间质纤维化损伤。在大鼠的肾脏系膜细胞中,高糖刺激可以使PRR发生自身磷酸化,进一步激活TGF-β/CTGF信号通路,参与糖尿病肾脏的损伤。同样在H9C2心肌细胞系中,PRR通过与肾素结合,募集早幼粒细胞白血病锌指蛋白并促进其核转位,增加下游靶基因的表达,促进细胞增殖,减少细胞凋亡。那么PRR是否在心脏成纤维细胞中也有表达呢?是否同样具有重要的病理生理功能呢?因此在本部分实验中,我们首先观察了酒精刺激大鼠原代心脏成纤维细胞中PRR的表达情况,然后通过一系列“功能获得”、“功能缺失”及“回复实验”,探究PRR在成纤维细胞酒精刺激损伤中的作用及分子机制。研究目的1.分离培养大鼠的原代心脏成纤维细胞并鉴定。2.体外构建成纤维细胞酒精刺激的损伤模型,观察PRR的表达及分布情况。3.通过一系列“功能获得”、“功能缺失”及“回复实验”,探究PRR在成纤维细胞酒精刺激损伤中的作用机制研究方法1.构建大鼠PRR基因过表达及PRR基因沉默腺病毒载体根据GeneBank记录大鼠PRR基因序列,构建含大鼠PRR基因的腺病毒过表达载体。根据基因沉默的技术原则,设计并合成3对针对大鼠PRR基因的shRNA,经过RT-PCR及Western blot实验,筛选出沉默效率最高的序列并合成腺病毒沉默载体行后续实验。2.原代心脏成纤维细胞的分离培养及鉴定利用出生1-3天的大鼠乳鼠,充分剪碎心肌组织,利用酶消化法分离培养心脏成纤维细胞,利用细胞免疫化学染色鉴定提取的成纤维细胞。3.原代心脏成纤维细胞酒精刺激药物干预及分组将生长状态良好的成纤维细胞接种于6孔板中,给予药物干预及酒精刺激,分组如下:①正常对照(Control)组,②酒精干预(Alcohol)组,③酒精+沉默对照(Scramble-shRNA)组,④酒精+PRR 沉默(PRR-shRNA)组,⑤酒精+PRR过表达(PRR)组,⑥酒精+PRR过表达+替米沙坦(PRR+Tel)组,⑦酒精+PRR过表达+PD98059(PRR+PD98059)组,⑧酒精+PRR过表达+替米沙坦+PD98059(PRR+Tel+PD98059)组,⑨酒精+PD98059 组。4.Western blot待酒精刺激结束后,收集各组细胞,提取总蛋白,行SDS-PAGE凝胶电泳,检测各组细胞中PRR、ERK1/2、p-ERK1/2、NOX4、TGF-β的表达水平,以GAPDH作为内参。5.ELISA待酒精刺激结束后,收集各组细胞培养上清,检测上清液中collagen Ⅰ、collagen Ⅲ 及 TGF-β的含量。6.氧化应激检测待酒精刺激结束后,行DHE染色,荧光显微镜下观察各组细胞氧化应激水平。7.NADPH氧化酶活性检测待酒精刺激结束后,收集各组细胞,严格按照说明书方法,检测各组细胞NADPH氧化酶活性。研究结果1.原代成纤维细胞的鉴定及酒精刺激成纤维细胞PRR的表达情况显微镜下观察生长状态良好的原代心脏成纤维细胞多成不规则形,少见长梭性。与心肌细胞不同,成纤维细胞无自主跳动,无团簇聚集现象,生长过于密集时可出现重叠现象。细胞免疫化学染色可见Vimentin染色阳性,细胞质里的中间丝骨架蛋白排列致密有序。Western blot及RT-PCR结果显示酒精刺激呈浓度依赖性和时间依赖性上调成纤维细胞PRR的表达,而且200mM刺激8h时表达上调最为明显(P<0.01)。接下来的细胞免疫荧光染色显示:PRR主要散在存在于细胞质中,细胞核周围区域尤为明显,细胞核内未见明显表达,细胞膜也可见PRR表达,酒精刺激能够明显增加PRR的荧光强度。2.PRR基因沉默对酒精刺激成纤维细胞NOX4、TGF-β蛋白表达及ERK1/2蛋白磷酸化水平的影响Western blot结果显示:与Control组相比,Alcohol组成纤维细胞PRR蛋白表达显著上调(P<0.01);与Alcohol组相比较,PRR-shRNA组PRR的表达水平显著降低(P<0.05)。酒精刺激同时还可以上调成纤维细胞NOX4、TGF-β蛋白表达及ERK1/2蛋白磷酸化水平(P<0.01),而PRR基因沉默均可以降低这些蛋白的上调。除此之外,Western blot结果显示:在我们所构建的体外模型中,各组间NOX1的蛋白表达水平无明显统计学差异(P=0.208);而无论是mRNA水平还是蛋白水平,我们所有组中均未检测出明显的NOX2的表达。3.PRR基因沉默减轻酒精刺激成纤维细胞的氧化应激水平DHE染色结果显示:与Control组相比,酒精刺激可以增强成纤维细胞DHE的荧光强度(P<0.01),同时还可以增加细胞匀浆中NADPH氧化酶的活性(P<0.01),而PRR基因沉默能够降低酒精刺激成纤维细胞DHE的荧光强度(P<0.05),降低细胞匀浆中NADPH氧化酶的活性(P<0.05)。4.PRR基因沉默减少酒精刺激成纤维细胞培养上清中collagen Ⅰ、collagen Ⅲ、TGF-β的含置各组细胞培养上清的ELISA检测结果显示:与Control组相比,Alcohol组成纤维细胞的细胞培养上清中collagen Ⅰ、collagen Ⅲ及TGF-β的含量显著增加(P<0.01),而PRR-shRNA组成纤维细胞的细胞培养上清中collagen Ⅰ、collagenⅢ及TGF-β的含量均有所降低(P<0.05)。5.替米沙坦对酒精刺激过表达PRR的成纤维细胞NOX4、TGF-β蛋白表达及ERK1/2蛋白磷酸化水平的影响Western blot结果显示:与Alcohol组相比,PRR基因过表达可显著上调PRR的蛋白表达水平,同时PRR基因过表达可进一步增加酒精刺激成纤维细胞NOX4、TGF-β蛋白表达水平及ERK1/2蛋白的磷酸化水平(P<0.05)。其中,替米沙坦能减轻由PRR过表达所引起的NOX4蛋白表达的上调(P<0.05),但是就TGF-β蛋白表达水平及ERK1/2蛋白磷酸化水平而言,我们并没有观察到PRR+Tel组与PRR过表达组之间具有统计学差异(P>0.05)。6.PD98059对酒精刺激过表达PRR的成纤维细胞NOX4、TGF-β蛋白表达水平及ERK1/2蛋白磷酸化水平的影响Western blot结果显示:无论是替米沙坦或PD98059单独使用还是联合使用,对于PRR过表达前提下PRR的表达无显著影响。与Alcohol组相比较,无论有无PRR过表达,PD98059均可以显著降低ERK1/2蛋白磷酸化水平(P<0.05);与Alcohol组相比较,只使用PD98059(Alcohol+PD98059组)就能够降低酒精所引起的成纤维细胞NOX4、TGF-β蛋白表达的上调(P<0.05);Alcohol+PRR+PD98059组中NOX4、TGF-β的蛋白表达与Alcohol组中NOX4、TGF-β的蛋白表达水平之间并无显著统计学差异(P>0.05)。就降低NOX4的蛋白表达而言,虽然在PRR过表达的前提下,替米沙坦也可以降低NOX4的蛋白表达(P<0.05)但是PD98059的效果要好于替米沙坦。就TGF-β的蛋白表达及ERK1/2蛋白磷酸化水平而言,PD98059的效果要明显好于替米沙坦(P<0.01),而两者合用可以更加显著降低NOX4、TGF-β蛋白的表达及ERK1/2蛋白磷酸化水平(P<0.01)。7.替米沙坦和PD98059对酒精刺激过表达PRR的成纤维细胞氧化应激的影响实验完成后行DHE染色及细胞匀浆NADPH氧化酶活性检测,结果显示:与Control组相比较,Alcohol组成纤维细胞DHE荧光强度增加(P<0.05),PRR过表达可进一步增加DHE的荧光强度(P<0.01);与PRR组相比较,PRR+Tel组和PRR+PD98059组成纤维细胞DHE荧光强度均有所下降(P<0.05),但是PRR+PD98059组的成纤维细胞DHE荧光强度下降更为明显,而两种药物合用组(PRR+Tel+PD98059)成纤维细胞DHE荧光强度下降最明显(P<0.05)。对于成纤维细胞匀浆NADPH氧化酶活性也有类似的趋势:与Alcohol组相比较,PRR组酶活性显著增高(P<0.05),而PRR+Tel组和PRR+PD98059组成纤维细胞匀浆NADPH氧化酶活性均有所下降(P<0.05),并且PRR+Tel+PD98059组成纤维细胞匀浆NADPH氧化酶活性下降最明显(P<0.05)。8.替米沙坦和PD98059对酒精刺激过表达PRR的成纤维细胞培养上清中collagen Ⅰ、collagen Ⅲ、TGF-β表达的影响实验完成后收集细胞培养上清行ELISA检测,结果显示:与Alcohol组相比,PRR过表达组的细胞培养上清中collagen Ⅰ、collagen Ⅲ及TGF-β的含量显著增加(P<0.01);与PRR组相比较,PRR+Tel组细胞培养上清中collagen Ⅰ、collagenⅢ含量有所下降(P<0.05),而TGF-β的含量下降不明显(P>0.05);单独使用PD98059可以使细胞培养上清中collagen Ⅰ、collagen Ⅲ、TGF-β的含量有所下降(P<0.05),而两种药物合用可以更加显著减低细胞培养上清中collagen Ⅰ、collagen Ⅲ 及 TGF-β的含量(P<0.05)。研究结论1、原代心脏成纤维细胞中有PRR的表达,且主要表达在胞质中,细胞核周围区域尤为明显,细胞核内未见明显表达,细胞膜可见PRR表达。2、PRR基因参与了酒精刺激成纤维细胞的损伤,PRR主要通过“PRR-ERK1/2-NOX4”信号通路参与成纤维细胞氧化应激及纤维化损伤。