目的:利用葡萄糖氧化酶(GO)制备体外人肝细胞(L-02)氧化应激损伤模型,验证藏方“甲嘎松汤”的保肝作用;研究其对L-02氧化应激损伤模型发展过程(损伤后Oh、4h、22h)的影响;利用三种化学物质(t-BHQ、ATRA、Genistein)干预转录因子Nrfl、Bachl,阐明甲嘎松汤的保肝作用机制。方法:1.雌雄均半的SD大鼠,连续3天每天2次灌胃不同剂量(0.66g生药/kg体重、0.33g生药/kg体重)的甲嘎松汤溶液,制备甲嘎松汤含药血清。在体外正常人肝细胞(L-02)中,分别加入不同体积比(20%、10%、5%)的甲嘎松汤含药血清及不同浓度(60μmol/L、30μmol/L、15μmol/L)的阳性对照药姜黄素,孵育不同时间点(6h、12h、24h)。通过利用MTT法检测细胞活力,来筛选制备甲嘎松汤含药血清的最佳条件,并确定甲嘎松汤含药血清作用于L-02细胞的最佳给药浓度及作用时间。2.以20%体积比的甲嘎松汤含药血清孵育正常人肝细胞(L-02)12h,然后以100U/L的G0体外诱导损伤人肝细胞(L-02)2h,收集细胞培养上清液。通过利用MTT法检测细胞存活率、赖氏法检测AST及ALT酶活力、硫代巴比妥酸法检测MDA含量、分光光度法检测GSH-Px酶活力,来验证甲嘎松汤对体外氧化应激损伤的人肝细胞(L-02)的保护作用。3.设置G0诱导的L-02氧化应激损伤发展变化的不同时间点(损伤后Oh、4h、22h),利用转录因子的化学干预剂,研究甲嘎松汤的作用机制:3.1 L-02细胞加入20%甲嘎松汤含药血清,孵育12h,再以100U/L的GO诱导损伤2h,然后换正常培养液,培养不同时间(0h、4h、22h),取样。3.2在化学物质(t-BHQ、ATRA、Genistein)干预L-02细胞12h后,加入20%甲嘎松汤含药血清孵育12h,再以以100U/L的GO诱导损伤2h,然后换正常培养液,培养不同时间(Oh、4h、22h),取样。不同时间点的样本检测指标:细胞活力、细胞培养上清液中AST、ALT酶活力、MDA含量及GSH-Px酶活力;制备细胞爬片,利用免疫荧光法观察转录因子Nrf2及Bachl在细胞内的位置变化;刮取细胞,利用Western blot检测细胞核内Nrf2及Bachl的蛋白表达量;直线相关性分析无化学干预剂时,甲嘎松汤组中的GSH-Px酶活力、MDA含量、Nrf2蛋白、Bachl蛋白在氧化损伤发展变化进程中的关系。结果:1.以0.66g生药/kg体重给大鼠灌胃,制备甲嘎松汤含药血清。20%的甲嘎松汤、30μmol/L的阳性药姜黄素分别作用于L-02细胞12h,细胞活力显著升高(P<0.01)。2.与空白血清对照组比较,空白血清模型组的细胞存活率及GSH-Px酶活力均显著降低(P<0.01);AST、ALT活力及MDA含量均显著升高(P<0.01)。与空白血清模型组比较,甲嘎松汤含药血清组的细胞存活率及GSH-Px酶活力均显著升高(P<0.01);AST、ALT活力及MDA含量均显著降低(P<0.01)。3.甲嘎松汤在L-02氧化应激损伤发展变化的不同时间点(损伤后0h、4h、22h)的作用规律:3.1在Oh、4h、22h,与空白血清对照组比较,空白血清模型组的细胞活力及GSH-Px酶活力均显著降低(P<0.01),且4h较Oh、22h显著降低(P<0.01);AST、ALT活力及MDA含量均显著升高(P<0.01),且4h较Oh、22h显著升高(P<0.01)。免疫荧光结果及Western blot结果均显示:空白血清模型组中,在Oh、4h、22h,细胞核内Nrf2蛋白表达量在4h最低;细胞核内Bachl蛋白表达量则随时间的延长而不断减少。3.2在Oh、4h、22h,与空白血清模型组比较,甲嘎松汤能显著升高细胞活力及GSH-Px酶活力(P<0.01),但4h时较Oh及22h低;并能显著降低AST、ALT活力及MDA含量(P<0.01),但4h时较Oh及22h高。免疫荧光结果及Western blot结果均显示:甲嘎松汤在Oh、4h、22h,均可显著升高细胞核内Nrf2表达(P<0.01),但在4h其表达量低于0h及22h;并能显著降低细胞核内Bachl的表达(P<0.01),且Bachl蛋白量随时间延长而降低。3.3相关性分析:甲嘎松汤组中,细胞核内Nrf2蛋白与GSH-Px酶活力随肝细胞(L-02)氧化应激损伤发展进程同期增强,呈正相关性(r =0.999,P=0.030)。4.在化学药物(t-BHQ、ATRA、Genistein)干预下,甲嘎松汤在L-02氧化应激损伤发展变化的不同时间点(Oh、4h、22h)的作用规律:4.1 t-BHQ促使Nrf2进入细胞核:与空白血清模型组比较,在Oh、4h、22h,“t-BHQ+空白血清模型”能显著升高细胞活力及GSH-Px酶活力(P<0.01),4h时较Oh及22h低;并能显著降低AST、ALT活力及MDA含量(P<0.01),4h时较0h及22h高。免疫荧光及Western blot结果显示:与空白血清模型组比较,“t-BHQ+空白血清模型”组在4h及22h显著升高细胞核内Nrf2蛋白表达量(P<0.01);在0h、4h及22h均可显著升高细胞核内Bachl蛋白表达量(P<0.01)。与“t-BHQ+空白血清模型”组比较,“t-BHQ+甲嘎松汤”能显著升高Oh、4h、22h的细胞活力及GSH-Px酶活力(P<0.01);并能显著降低AST、ALT活力及MDA含量(P<0.01)。免疫荧光结果及Western blot结果均显示:与t-BHQ比较,在Oh、4h、22h,“t-BHQ+甲嘎松汤”均可显著升高细胞核内Nrf2的表达量(P<0.01),但4h表达量最低;同时均可显著降低细胞核内Bachl的表达量(P<0.01),但 22h 高于 Oh 及 4h。4.2 ATRA抑制Nrf2进入细胞核:与空白血清模型组比较,“ATRA+空白血清模型”在22h明显降低细胞活力(P<0.05);对三个时间点的ALT及AST活力无影响(P>0.05);显著升高Oh及22h的MDA含量(P<0.01);升高三个时间点的GSH-Px酶活力,但没有统计学意义(P>0.05)。免疫荧光及Western blot结果显示:与空白血清模型组比较,“ATRA+空白血清模型”组在Oh显著降低细胞核内的Nrf2蛋白表达量(P<0.01),但在4h及22h显著升高核内Nrf2蛋白表达量(P<0.01);同时可在三个时间点显著升高细胞核内Bachl蛋白表达量(P<0.01),且随时间延长而减少。与“ATRA+空白血清模型”组比较,“ATRA+甲嘎松汤”能显著升高Oh、4h、22h的细胞活力及GSH-Px(P<0.01);并能显著降低AST、ALT活力及MDA含量(P<0.01)。免疫荧光结果及Western blot结果均显示:与ATRA组比较,在Oh、4h、22h,“ATRA+甲嘎松汤”均可显著升高细胞核内Nrf2的蛋白表达量(P<0.01),4h最高;在Oh及4h均可显著降低细胞核内Bachl的蛋白表达量(P<0.01),但随时间增加,表达量逐渐升高。4.3 Genistein抑制Bachl移出细胞核:与空白血清模型组比较,“Genistein+空白血清模型”在0h及22h显著降低细胞活力(P<0.05);可显著升高三个时间点的ALT活力(P<0.01),升高AST活力(P>0.05);显著升高0h及22h的MDA含量(P<0.01)。升高三个时间点的GSH-Px酶活力,但没有统计学意义(P>0.05)。免疫荧光及Western blot结果显示:与空白血清模型组比较,“Genistein+空白血清模型”组可显著升高三个时间点的细胞核内Nrf2蛋白表达量(P<0.01),且4h最高;同时可显著升高三个时间点的细胞核内Bachl蛋白表达量(P<0.01),且随时间延长逐渐升高。与“Genistein+空白血清模型”组比较,“Genistein+甲嘎松汤”能显著升高Oh、4h、22h的细胞活力及GSH-Px(P<0.01);并能显著降低AST、ALT活力及MDA含量(P<0.01)。免疫荧光结果及Western blot结果均显示:与Genistein比较,在Oh、4h、22h,“Genistein+甲嘎松汤”均可显著降低细胞核内Nrf2的蛋白表达量(P<0.01),但4h最高;同时均可显著降低细胞核内Bachl的蛋白表达量(P<0.01),但4h最高。结论:1.甲嘎松汤对体外正常人肝细胞(L-02)没有损伤作用,反而可提高细胞活力。20%甲嘎松汤含药血清对G0诱导2h的L-02氧化应激损伤模型,可明显改善氧化应激损伤,有显著的保护作用。2.体外人肝细胞(L-02)受到GO诱导损伤2h后,其损伤程度随着时间延长的发展变化规律是:从损伤后Oh到4h,损伤程度逐渐增强;从损伤后4h到22h,损伤程度逐渐减弱。损伤后4h时,损伤程度最严重。3.甲嘎松汤在L-02细胞氧化应激损伤发展变化的过程(Oh、4h、22h)中,均可显著促进Nrf2进入细胞核,升高其核内蛋白表达量,同时显著促进Bachl移出细胞核,降低其核内蛋白表达量,来升高抗氧化酶GSH-Px活力,但在损伤发展到4h时,甲嘎松汤的保护作用则低于Oh及22h。4.本实验结果验证了 t-BHQ可促进Nrf2进入细胞核、ATRA可抑制Nrf2进入细胞核及Genistein可抑制Bachl移出细胞核的报道。本实验发现了 t-BHQ可促使Bachl在损伤发展过程中逐渐进入细胞核,增加其核内蛋白量;发现ATRA在损伤后4h及22h可升高细胞核内Nrf2蛋白表达,并同时显著升高三个时间点细胞核内Bachl的蛋白量;发现了 Genistein可同时使核内Nrf2与Bachl的蛋白量升高,但不能升高抗氧化酶GSH-Px的活力,表现出细胞损伤的加剧。5.三个干预剂和甲嘎松汤联用的结果显示,甲嘎松汤可协同t-BHQ升高核内Nrf2蛋白量,对抗ATRA的降低核内Nrf2的作用;对抗Genistein的升高核内Nrf2的作用;同时对抗Genistein升高细胞核内Bachl蛋白量的作用,并在t-BHQ、ATRA干预下,可促进Bachl移出细胞核,降低其核内蛋白量,并且在这三个干预过程中均表现出抗氧化酶GSH-Px活力相应增强。综上所述,在肝细胞氧化损伤发展进程中,甲嘎松汤可能是通过调节细胞核内Nrf2及Bachl的蛋白表达量,平衡二者在细胞核内的蛋白水平,进而调控抗氧化酶GSH-Px活力,来达到抗氧化保肝的作用。