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随着社会的发展和各方面竞争压力的增加,负性应激,特别是负性心理应激已成为一个不可忽视的因素威胁着人们的健康。超过个体承受能力的负性心理应激,往往是多种疾病的根源,特别是精神疾患,如抑郁症。因此,研究负性心理应激的中枢机制及抗应激药物的生物学效应对应激相关性精神障碍的防治具有十分重要的意义。然而,与心理社会应激相关的中枢环路及抗应激药物的作用机制目前尚未完全明确,是现今医学有待解决的重要问题之一。已知细胞外信号调节激酶( extracellular signal-regulated kinase1/2, ERK1/2)是促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)家族中的重要成员,该家族的信号转导通路对调节神经细胞的生长、增殖、分化和存活起关键作用。近年来发现,信号转导分子ERK1/2在应激诱发的脑内神经元活动中具有重要作用,其磷酸化已被作为一个新的神经元活动的标志物用于功能形态学研究。而环磷酸腺苷反应单元结合蛋白(cAMP response element binding protein, CREB)是一种重要的核蛋白,属于结构相关转录因子CREB家族成员之一,其调节启动子中具有环磷酸腺苷反应单元(cAMP response element,CRE)的基因转录。这种核转录因子具有调节包括学习记忆在内的广泛的生物学功能,是细胞内多种信号通路的一种关键成分。包括环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)通路、Ras/ERK通路等在内的多种信号转导通路均涉及CREB的磷酸化及其活化作用。CREB是一个潜在的转录活化剂,其表达和/或活性的变化,会影响包括脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)在内的多种下游靶基因的调节,从而影响抗心境障碍药物的总体效应。本研究在建立大鼠慢性束缚应激模型的基础上,运用旷场试验、Morris水迷宫等行为学方法及蛋白免疫印迹分析(Western blot)和免疫组织化学方法,探讨大鼠慢性束缚应激后探究行为、空间记忆能力的改变及脑内应激相关核团ERK1/2、CREB磷酸化水平的变化;同时观察应激前和应激期间预防性给予5-羟色胺再摄取抑制剂(selective serotonin reuptake inhibitor, SSRIs)-西酞普兰(citalopram)对大鼠上述变化的影响,为阐明负性应激中枢机制提供理论依据,并为临床治疗及预防应激相关精神障碍时选择药物提供新思路。目的:1.单纯及预防性给予大鼠SSRIs对其探究行为、空间记忆能力的影响。2.慢性束缚应激大鼠额前叶皮质(prefrontal cortex, PFC)中磷酸化ERK1/2(phosphorylated-ERK1/2, p-ERK1/2)、总ERK1/2水平的变化。3.应激前和应激期间预防性给予SSRIs对大鼠脑内应激相关核团中ERK1/2、CREB磷酸化水平的影响。方法:1.单纯及预防性给予大鼠SSRIs对其探究行为、空间记忆能力的影响雄性SD大鼠随机分为4组:正常对照组(normal control, NC, N=6),束缚应激组(restraint stress, RS, N=6),单纯西酞普兰组(only citalopram, OC, N=6)及西酞普兰预处理组(citalopram prophylaxis, CP, N=6)。RS组动物腹腔内注射(intraperitoneal, i.p.)生理盐水,1 ml/d,OC组和CP组动物腹腔内注射西酞普兰,10 mg/(kg?d),连续7 d。然后对RS组和CP组动物均给予束缚应激,方法为每天9:00-15:00将大鼠置于特制的束缚器内限制其行动自由,连续21d。在束缚期间禁食,禁水。应激期间RS组和CP组每日束缚前分别给予生理盐水和西酞普兰,OC组相同时间给予西酞普兰,剂量同束缚应激前。NC组和OC组动物仅在其它两组动物每日应激相应时间也禁食,禁水,未进行束缚应激处理。束缚应激结束后当日对大鼠进行旷场测试;束缚实验结束前1 w开始利用Morris水迷宫对大鼠进行空间记忆训练,束缚应激结束当日对大鼠进行空间记忆能力测试。2.慢性束缚应激大鼠PFC中p-ERK1/2、总ERK1/2水平的变化雄性SD大鼠随机分为2组: NC组(N=3),RS组(N=3)。实验方法同1。束缚应激结束后,所有大鼠迅速断头处死。观察两组大鼠PFC中p-ERK1/2和总ERK1/2水平的变化。3.预防性给予SSRIs对大鼠脑内应激相关核团中ERK1/2、CREB磷酸化水平的影响雄性SD大鼠随机分为3组: NC组(N=6),RS组(N=6)及CP组(N=6)。各组动物实验方法同1。束缚应激结束后,所有大鼠立即处死。观察各组大鼠脑内应激相关脑区、核团中ERK1/2、CREB磷酸化水平的变化。结果:1.单纯及预防性给予大鼠SSRIs对其探究行为、空间记忆能力的影响经过21 d慢性束缚应激后,与NC组相比, RS组大鼠旷场试验的水平活动度明显减少,中央停留时间明显增加,差异有统计学意义(P<0.05);OC组大鼠的旷场试验行为没有明显变化。CP组大鼠旷场试验的水平活动度较RS组显著增加,中央时停留间则明显减少,差异有统计学意义(P<0.05)。经过21 d慢性束缚应激后,与NC组相比,RS组大鼠的目标象限活动时间和穿越站台次数明显减少,差异有统计学意义(P<0.05);OC组大鼠的检测结果无明显变化。CP组大鼠目标象限活动时间和穿越站台次数较RS组显著增加,差异有统计学意义(P<0.05)。2.慢性束缚应激大鼠PFC中p-ERK1/2、总ERK1/2水平的变化RS组大鼠PFC中p-ERK1/2水平较NC组低,差异有统计学意义(P<0.05),而总ERK1/2的水平没有明显改变。3.预防性给予SSRIs对大鼠脑内应激相关核团中ERK1/2、CREB磷酸化水平的影响p-ERK1/2阳性细胞在NC组大鼠脑内分布较为广泛,我们着重观察了一些与应激相关的脑区、核团。在PFC、杏仁内侧核(medial amygdaloid nucleus, MeA)、杏仁皮质后内侧核(posteromedial cortical amgydala nucleus, PMCo)、隔区的外侧核腹侧部(lateral septal nucleus, ventral part, LSV)及终纹床核(bed nucleus of the stria terminalis, BNST)均有较多p-ERK1/2阳性细胞分布。RS组大鼠的PFC、MeA、PMCo、LSV及BNST中p-ERK1/2阳性细胞数较NC组明显减少,细胞染色较浅,突起染出少,差异有统计学意义(P<0.05)。CP组大鼠在以上各脑区、核团中p-ERK1/2阳性细胞数较RS组明显增多,细胞染色浓,突起染出多,差异有统计学意义(P<0.05)。同样,磷酸化CREB(phosphorylated-CREB, p-CREB)阳性细胞在NC组大鼠脑内分布也较为广泛。其中PFC内的阳性细胞数量多,位于皮质浅层。海马齿状回(DG)、杏仁中央核(central amygdaloid nucleus, CeA)、MeA和PMCo也有较多的p-CREB阳性细胞表达。RS组大鼠在上述脑区、核团中p-CREB阳性细胞数较NC组明显减少,染色浅,差异有统计学意义(P<0.05)。CP组大鼠在以上各脑区、核团中p-CREB阳性细胞数较RS组明显增多,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:1.慢性束缚应激后大鼠的探究行为及空间记忆明显受损;应激前和应激期间预防性给予西酞普兰处理,能明显缓解应激对大鼠行为学改变造成的不良影响而发挥抗负性应激作用;而单纯给予大鼠西酞普兰没有影响大鼠在旷场及Morris水迷宫中的表现。2.慢性束缚应激后大鼠PFC内p-ERK1/2水平明显降低,而总ERK1/2水平没有改变,提示信号分子ERK1/2磷酸化可能与负性应激的中枢机制有关。3.慢性束缚应激改变了大鼠PFC、CeA、MeA、PMCo、DG、LSV及BNST等部位ERK1/2及CREB磷酸化的水平,这一结果提示上述脑区、核团可能与负性应激的中枢调控有关,而ERK1/2、CREB信号转导通路参与了其调控过程;预防性给予大鼠西酞普兰能够增加上述脑区、核团中ERK1/2及CREB的磷酸化水平,提示西酞普兰可能通过ERK1/2、CREB信号转导通路发挥了其抗应激效应。这些结果可能有助于在临床上选择抗应激药物。