背景：尽快研制出安全、有效、可逆和能广为接受的男用避孕药是男性抗生育研究的当务之急，而激素避孕是男性避孕研究的突破口。合并孕激素和／或睾丸局部物理加热，可以增强雄激素诱导的生精细胞凋亡，抑制精子发生。假设激素处理为“hit 1”，睾丸局部热处理为“hit 2”，两者分别通过不同的死亡信号通路、诱导不同细胞特异的生精细胞凋亡，两种处理联合（“two hits”）将更加完全、更加快速地抑制精子发生，而且完全是可恢复性的。然而，外源性雄激素抑制精子发生达到抗生育作用的深层次的分子机制仍然不清楚。定性和定量研究一些雄激素抑制精子发生分子通路上的蛋白质，将可能成为发展男性避孕的新靶点，因为这些靶蛋白可被用于设计新的药物分子。这些分子单用或联合应用，可以开启或关闭生精细胞凋亡，达到简单、安全、可恢复的男性避孕，或者男性不育症的治疗。此外，对加热和／或激素对精子发生影响及机制，有助于理解环境因素（如热、毒物、内分泌干扰物）对男性生殖健康的损害，为预防和减少环境因素对男性健康危害提供依据。目的：本项研究中，观察和比较雄激素合并睾丸局部物理加热或者合并孕激素是否加速睾酮诱导的精子发生抑制作用，达到更完全、更迅速、可逆的抗生育作用。用现代分子生物学和蛋白质组学技术研究雄激素抗男性生育的作用机制，寻找雄激素作用的关键蛋白质，这些蛋白质将可能成为发展男性避孕的新靶点，或者为男性不育症的治疗提供依据。对象、材料和方法：本研究设计包括4周观察期、18周治疗期、12周恢复期三个阶段。72名有生育能力的健康成年男性志愿者随机分为4组（n=18／组），治疗处理如下。1)TU组：十一酸睾酮（TU）：TU1000mg IM（首剂剂量），然后每6个星期500mg IM共2次，是分别在治疗期第6周和第12周，之后无继续治疗措施；2)Heat组：在治疗期第1周无治疗处理，第2周内每天1次，每次30分钟，浸泡阴囊（睾丸）在43℃温水中，连续6天，之后无继续治疗措施；3)TU+Heat组：TU肌肉注射和睾丸局部加热的组合，过程同TU组和Heat组；4)TU+LNG组：TU注射的同时，联合每天口服左炔诺酮（LNG）250μg，口服LNG是从治疗期第1天直到第18周完成。在观察期、治疗期每3周、恢复期每4周，不同时间点上检查精液、血生化、血脂、激素（FSH、LH、T、E2、SHBG）、前列腺特异抗原（PSA）、体格检查、测量睾丸大小、填写性功能调查表。治疗前（4例）和治疗后2、9周（各4例）做睾丸活检（共36例），作组织学分析。在蛋白质组学的研究中，选择了治疗前的4例睾丸活检（正常对照）和TU治疗2周的4例睾丸活检（TU治疗组）。其他睾丸活检组织保存在液氮中，留待后续的研究。采用双向凝胶电泳（2-DE）和激光时间飞行质谱分析（MALDI—TOF／TOF）结合生物信息分析、Western blotting、免疫组织化学分析方法进行研究。结果：一、雄激素抗生育的临床研究TU组：TU注射后精子计数逐渐减少，但相对较慢，在第6周时平均精子计数降低到62.4×10⁶／ml（平均仅减少了14.9×10⁶／ml，19.3％）；在第18周时才达到最大的抑制，平均精子计数降低到3.8（平均减少了63.5，95.1％）×10⁶／ml。Heat组：加热处理之后，在第6周时平均精子计数降到最低，为20.9×10⁶／ml（比处理前减少59.1×10⁶／ml，74.9％）；然后逐渐恢复，第12周时恢复到治疗前的基线水平。该组任何时间点上没有1个受试者精子计数少于3×10⁶／ml。TU+Heat组：平均精子计数既快又强地降低，第6周时降低到10.9×10⁶／ml（比处理前减少了64.8×10⁶／ml，85.6％）；从第6周直到第18周（治疗期结束），平均精子计数维持在非常低的水平。在第6周时，Heat组和TU+Heat组平均精子计数均显著低于TU组，P＜0.0001；但Heat组和TU+Heat组两组之间没有进一步的差异（P=0.26）。在第9周时，Heat组平均精子计数走向恢复，而TU组进一步降低，TU+Heat组则更明显地降低，比治疗前降低了69.3×10⁶／ml。说明TU和Heat的联合应用能比任何单用的处理更显著地降低精子计数（P＜0.0005）。与单纯TU组比较，TU+LNG组平均精子计数降低幅度更大。在第6周时，TU+LNG组平均精子计数降低到37.3×10⁶／ml（比处理前减少了39.4×10⁶／ml，51.4％），与TU组有显著差异（P＜0.0001），但显然不及TU+Heat组（P＜0.0001）。在第9周时，T+LNG组平均精子计数进一步持续降低，直到治疗期结束，平均精子计数降到0.06×10⁶／ml（比处理前减少了76.6×10⁶／ml，99.9％），显著低于其他3组（P＜0.001）。在恢复期结束，所有各组的平均精子计数恢复到＞20×10⁶／ml的水平。在第18周时，TU组、TU+Heat组和TU+LNG组达到无精子的例数分别为7／18、6／18和17／18。同样地，达到少精子（＜20×10⁶／ml）和严重少精子（＜5×10⁶／ml）的人数在相关时间点上（12、15、18、22周）也存在同样的差异，只在第12周时TU+LNG与TU+Heat组该值类似；在第9周时，TU+Heat组较其他组达到更多的少精子症。Heat组血总T水平变化不显著。每次TU注射之后，TU组、TU+Heat组和TU+LNG组的血总T和游离T水平均升高，然后恢复，三组之间没有差异（P=0.20）。平均血清SHBG水平在单纯Heat组没有变化，在TU组和TU+Heat组有小的降低，而TU+LNG组较其他应用TU的组则有较大的降低（降到基线水平45％）（P＜0.002）。每次TU注射后，随着血清总T和游离T增加，TU、TU+Heat组和TU+LNG组的平均血清LH、FSH水平显著降低；TU+LNG组在第1次TU注射后即显著降低（P＜0.0001），并维持在低于0.5IU／L的水平，每个时间点上均显著低于其他组（P＜0.003）。平均血清抑制素水平在Heat和TU组未见显著改变，但在TU+Heat组（下降15％，P=0.05）和TU+LNG组（下降34％，P＜0.001）则有显著下降。睾丸活检的受试者，血抗精子抗体短时间、一定程度的增加（IgM型ASAb达到P＜0.05），但实测值均在正常范围内。治疗处理对性功能、血生化、血脂等没有显著影响。睾丸组织活检检查发现：与治疗前比较，TU组和TU+LNG组在第2周时没有可以辨别的组织学变化；在第9周时，生精小管直径显着缩小，精母细胞和精原细胞减少。Heat组和TU+Heat组在第2周时生精小管外形没有显著变化，管壁厚度变化亦不明显，但细胞层次欠清楚，管腔内见有生精细胞脱落，TU+Heat组则更加明显；第9周时，Heat组与处理前没有差异，表明组织结构已经恢复；TU+Heat组与TU组比较，生精小管变化更明显，生精细胞数量进一步减少。二、雄激素抗生育的蛋白质组学研究选择治疗前（4例）和TU治疗2周（4例）受试者的活检睾丸组织作蛋白质组学研究，拟在今后获得经费支持后继续进行其他组的蛋白质组研究。TU组与对照组比较，有17个蛋白点具有统计学差异（P＜0.05），14个蛋白点被鉴定，这14个点为13种已知的蛋白质，其中有2个点为同一种蛋白。我们观察到其中8个蛋白质参与复杂的功能网络，主要是参与细胞组装和细胞存活的二个生理过程。此外，4个蛋白质CALB₂、SOD₂、hnRNPK和PSMF₁同时参与了多种生理过程，这些蛋白被认作为TU作用的关键蛋白。4个蛋白质，包括CALB₂、SOD₂、DDX₄和PSMF1被进一步验证。Western blot显示，TU处理2周时，CALB₂和Rbp1水平降低，SOD₂和DDX₄水平升高，这与Image Master^TM2D Platinum Software分析的结果完全一致。免疫组织化学显示，CALB₂在Leydig细胞细胞质中有一定量的表达，但在生精细胞之中几乎无免疫染色；SOD₂在Leydig细胞细胞质强表达，在Sertoli细胞中等表达，生精细胞中也有一定量的SOD₂存在，在早期精母细胞和精原细胞较强表达，中晚期精母细胞中等表达；DDX₄在生精细胞表达，主要定位于精母细胞和圆形精子细胞；Rbp1在Leydig细胞和Sertoli细胞细胞质表达，生精细胞中弱表达。TU处理2周，CALB₂、DDX₄、Rbp1表达变化在显微镜下观察不显著；SOD₂表达增加，主要是中晚期精母细胞。免疫组织化学是表达蛋白的细胞定位和定性分析的方法，但进行组间比较时相对不敏感，难以进行定量分析，所以未能发现CALB₂、DDX₄、Rbp1表达差异。结论外源性雄激素能够抑制精子发生，短暂、温和的睾丸局部加热引起快速精子发生抑制作用，而且快速恢复；TU联合加热处理则比单纯TU更显著、更快速抑制精子发生。同样，孕激素进一步加强TU单用的精子发生抑制作用。从临床实践中证实了抑制精子发生的“双重打击”的学说。就雄激素合并的睾丸加热或者孕激素而言，加热能够显著加速雄激素作用，而孕激素能够显著增强雄激素作用。外源性T通过抑制促性腺激素和睾内T水平抑制精子发生，可能是作用于细胞装配和细胞存活等生物学过程。外源性T首先是改变了一系列蛋白质表达，CALB₂、SOD₂、hnRNPK和PSMF₁4种蛋白质是T作用的关键蛋白，这些蛋白质是导致精子发生抑制的候选的和潜在分子靶标。对这些蛋白质功能的进一步研究，将提供男性激素避孕确切机制的更多信息。