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动脉血栓形成是在急性缺血性心脑血管疾病的主要发病机制,最近研究表明微血栓形成在心血管疾病中同样扮演着重要角色。但目前临床缺乏微血栓的检测手段,本研究评估了基于纳米颗粒的冠脉微血栓多模态靶向分子显像的可行性。在评价SPIO致凝性基础上,利用SPIO作为载体连接CREKA分子短肽及IR783荧光探针,构建SPIO-CREKA纳米颗粒,并在体外试验验证了SPIO-CREKA对纤维蛋白的靶向结合能力。体内试验中,利用心脏缺血再灌注方法成功构建大鼠心脏微血栓模型,静脉注射SPIO-CREKA 后,成功实现心脏微血栓的多模态分子显像(MRI及活体光学显像)。第一部分：SPIO体外致栓性的研究目的：通过探讨体外不同浓度50 nmSPIO的致栓性,评价其作为药物载体的安全性。方法：以PBS为对照组,将0.02 mg/ml、0.1 mg/ml、0.5 mg/ml浓度的SPIO与血浆或全血在体外共孵育,检测血小板聚集率、凝血功能、血凝块质量及血栓弹力图。结果：(1)PBS组、0.02 mg/ml SPIO组、0.1 mg/ml SPIO组及0.5 mg/ml SPIO组血小板聚集率分别为67.3±5.9%、68.3±4.5%、66.2±5.5%及69.5±5.9%(P>0.05)；(2)4组的APTT值分别为28.1±2.7 S、28.5±2.4 S、28.2±2.5 S及29.1±±3.6S(P>0.05),PT值和TT值各组间也无统计学差异(P>0.05)。(3)血栓弹力图各参数(反应凝血功能的R时间、反应纤维蛋白原功能的K时间及α角、反应血小板功能的MA值、凝血综合指数CI),各组间比较差异均无显著性(P>0.05)。(4)4组的血凝块质量分别为759.6±38.7 mg、758.8±47.2 mg、769.8±39.2 mg和766.8±40.8 mg,组间比较无统计学差异(P>0.05)。结论：50 nmSPIO在一定浓度范围内(0.02mg/ml-0.5mg/ml)对血小板聚集、凝血功能、血凝块质量及血栓弹力图均无明显影响,表明其无致栓性,血液相容性较好,可较为安全的应用于血栓性疾病的研究。第二部分SPIO-CREKA的制备及表征目的：构建可靶向纤维蛋白的多功能荧光磁性纳米体系,用于微血栓的多模态检测,并检测该磁性纳米体系的表征及体外致栓性。方法：将荧光探针与SPIO连接后,PEG修饰SPIO,并通过Maleimide-PEG与CREKA共价结合,得到IR783-R-SPIO-CREKA。通过动态光散射法检测SPIO-CREKA粒径、粒径分布宽度以及表面膜电位,透射电镜观察粒子形态。分别使用紫外分光光度法、荧光分光光度法、紫外分光光度法及高效液相色谱法检测IR783、rhodamine、PEG及CREKA连接效率。通过不同浓度SPIO-CREKA与血浆共孵育,检测其对凝血功能及血小板聚集率的影响,评估SPIO-CREKA致栓性。结果：SPIO-CREKA粒径分布集中(PDI<0.25),粒径集中分布在100nm左右,电位在-2.2mv左右。透射电镜观察发现SPIO-CREKA中间为一直径为10-20nm密度较大的磁核,外面被一层葡聚糖包裹。每个SPIO磁珠表面连接有300IR分子、1500个Rhodamine分子、6000个PEG分子及2000 CREKA分子,可有效地利用荧光显微镜、活体成像等技术检测SPIO在大鼠体内的分布。不同浓度SPIO-CREKA对APTT、PT、TT及血小板聚集率无明显影响(各组间比较P>0.05),其致凝性较低,可安全的应用于体内微血栓的靶向显像。结论：本研究利用多功能SPIO为载体,携载近红外荧光探针及靶向纤维蛋白分子CREKA,构建了可对血栓性疾病进行多模态无创显像(MRI及活体光学显像)纳米体系,该纳米体系表面荧光探针及CREKA密度高,致栓性低,可安全的应用于微血栓多模态成像的研究。第三部分大鼠心肌缺血再灌注后微血栓的表达及其机制的初步研究目的：检测大鼠心肌缺血再灌注24h后是否有微血栓的形成及其主要成分,并对微血栓产生机制做初步探讨。方法：制作大鼠心肌缺血再灌注模型,通过即刻心电图描记及心超、心脏组织病理学检测评价模型成功性,通过对纤维蛋白免疫荧光染色观察微血栓的形成及分布,通过透射电镜检测确定微血栓主要成分,通过对缺血局部心肌TF及PAI-1免疫组化染色,初步探讨微血栓形成的可能机制。结果：大鼠心肌缺血再灌注24h后,I/R组大鼠左室前壁左前降支供血范围内可见纤维蛋白沉积,而左室后壁、右室及sham组大鼠心脏内均未见纤维蛋白表达。激光共聚焦显微镜观察可见纤维蛋白网罗血细胞在小血管内形成微血栓。透射电镜观察可见微血栓的主要成分为纤维蛋白、血小板及红细胞。I/R组大鼠缺血心肌局部较sham组大鼠反应TF及PAI-1升高。结论：大鼠心肌缺血再灌注24h后缺血局部有微血栓形成,其成分包括纤维蛋白、血小板及红细胞。心脏缺血局部TF及PAI-1表达升高,提示心肌缺血局部凝血系统与纤溶系统失平衡可能是导致微血栓形成的原因之一。第四部分：大鼠心肌缺血再灌后微血栓的多模态显像目的：检测IR783标记的SPIO-CREKA对纤维蛋白的靶向能力,对大鼠心脏微血栓进行多模态分子显像。方法：通过SPIO-CREKA与纤维蛋白栓子共孵育,分别通过荧光显微镜、光学活体成像系统及MRI成像系统体外验证SPIO-CREKA与纤维蛋白的靶向结合能力及对血栓的成像能力；制作大鼠心肌缺血再灌注模型,尾静脉注射PBS、SPIO-PEG及SPIO-CREKA,并使其循环4h,通过心脏组织学检查及电镜观察验证SPIO-CREKA体内与微血栓靶向结合能力,通过MRI及光学成像系统检测SPIO-CREKA对微血栓的靶向多模态分子显像能力,并通过器官离体成像研究SPIO-CREKA在各组织的分布。结果：(1)体外试验中,荧光显微镜观察SPIO-CREKA组在纤维蛋白栓子表面可见红色荧光,而PBS组及SPIO-PEG组均无明显荧光；在活体成像下观察血栓凝块可见SPIO-CREKA组荧光强度为SPIO-PEG组的7.5倍,P<0.001；MRI成像中,SPIO-CREKA组在MRI显示为低信号,信号值为(66.4±13.7)而SPIO-PGE组信号改变不明显,为(201.8±11.0),PBS组信号值为(210.9±17.2),SPIO-CREKA组与SPIO-PEG组及PBS组比较,P<0.001。(2)在大鼠心脏缺血再灌注24h后,心脏局部微血栓形成模型中,大鼠接受尾静脉注射相应纳米材料4h后进行磁共振显像。SPIO-CREKA组大鼠心脏左室前壁损伤区在T2加权像是显示为低信号,LVAM相对信号强度为(0.65±0.07),SPIO-PEG组为(0.95±0.08),PBS组为(0.99±0.11),SPIO-CREKA组与其相比,P<0.01,sham组接受SPIO-CREKA其LVAM相对信号强度为(0.92±0.06)。心脏离体光学成像示：SPIO-CREKA组心脏局部荧光强度是SPIO-PEG组的1.95倍(1.88±0.5×107vs.0.96±0.09×107,P<0.001),PBS组荧光强度为0.99±0.1×107,sham+SPIO-CREKA组荧光强度为0.94±0.1×107。SPIO-CREKA及SPIO-PEG主要分布在肝脏及肾脏内,连接CREKA并未改变SPIO组织分布。心脏组织学检测：大鼠I/R后组织切片共聚焦发现,SPIO-CREKA组SPIO-CREKA结合在微血栓表面,而PBS组及SPIO-PEG组未见明显红色荧光。电镜观察提示血管壁、血小板及红细胞等表面可见密度较大的SPIO-CREKA颗粒。结论：本研究利用SPIO作为载体,连接靶向纤维蛋白的CREKA分子短肽及IR783荧光探针,实现了对大鼠心肌微血栓的多模态无创显像。