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结肠癌是人类最常见的消化道肿瘤之一,其发病率和死亡率多年来居高不下。近年来随着化疗方案的不断更新使得结肠癌的治疗效果有所提升,但患者对治疗反应不一,获益率差异较大,以及由耐药引起的复发和转移是进一步提高疗效的主要障碍。代谢模式的多样性是恶性肿瘤的重要特征,其不仅在肿瘤发生发展中发挥重要作用,同时也是恶性细胞在面对化疗压力时得以存活的根本保障。因此,深入研究结肠癌化疗耐受情况下肿瘤代谢改变及调控机制,不仅可以阐明结肠癌化疗耐受的分子机制,而且可以通过对特定细胞代谢途径或代谢产物的调控,为逆转耐药寻找新的靶点。缺氧是实体肿瘤的重要特征之一,而缺氧诱导因子1α（HIF-1α）作为其关键的中间分子,在对肿瘤代谢等方面起着主要的调控作用。同时缺氧条件下谷氨酰胺（Gln）的转运、合成与利用均增加,但是具体的分子机制目前尚不明确。Gln在其代谢关键酶2型谷氨酰胺酶（GLS2）的作用下脱氨基生成谷氨酸（Glu）。一方面,Glu可反应生成α-酮戊二酸进入三羧酸循环（TCA循环）起“回补作用”,从而为TCA循环提供因肿瘤细胞合成代谢增强而减少的中间代谢产物;另一方面,Glu可在谷胱甘肽合成酶系的催化下,生成谷胱甘肽（GSH）与多种化疗药物反应,增加药物的排出,降低药物在细胞内的浓度以及增强DNA损伤修复功能,最终引起肿瘤细胞的耐药。在本研究中,我们发现缺氧条件下结肠癌细胞株对化疗不敏感,同时耐药结肠癌细胞株中HIF-1α和GLS2的表达均升高,在此基础上,初步探讨了HIF-1α通过对GLS2进行调控影响了谷氨酰胺的代谢,最终引起结肠癌化疗耐受,为逆转耐药提供新的策略。同时,采用免疫组化法检测了HIF-1α和GLS2在结直肠癌组织标本中的表达,并且探讨其临床意义,进而为临床诊治提供新的线索。实验方法:第一部分（1）分别在常氧（20%O2）和缺氧（1%O2）不同时间点（12h、24h、36h、48h、72h）的条件下处理结肠癌细胞株Lovo后,Western Blot检测HIF-1α的表达;（2）分别在20%O2和1%O2条件下用结肠癌化疗药物奥沙利铂（OXA）和5-氟尿嘧啶（5-Fu）处理Lovo细胞48h后,CCK8检测细胞增殖活性;（3）Western Blot检测HCT-116、HCT-116/OXA、HCT-8和HCT-8/5-Fu中HIF-1α、缺氧诱导因子2α（HIF-2α）、1型谷氨酰胺酶（GLS1）和GLS2的表达。第二部分（1）通过慢病毒敲低HIF-1α,构建HIF-1αKD的Lovo细胞株,在20%O2和1%O2处理12h后,Western Blot检测HIF-1α和GLS2的表达;（2）通过慢病毒过表达HIF-1α,构建HIF-1αOE的Lovo细胞株,Western Blot检测HIF-1α和GLS2的表达;（3）通过临床数据库ICGC对GLS2和不同HIF-1α靶基因之间的表达相关性进行分析;（4）通过基因数据库分析GLS2启动子序列与HIF-1α靶基因序列的相似程度;（5）荧光素酶报告基因检测HIF-1α对GLS2转录的启动活性。第三部分（1）通过慢病毒敲低HIF-1αOE组Lovo细胞中的GLS2,构建HIF-1αOE+GLS2KD Lovo细胞株;（2）GSH检测试剂盒分别检测WT、Ctr、HIF-1αOE、HIF-1αOE+GLS2KD四组Lovo细胞中GSH水平;（3）分别用OXA和5-Fu处理WT、Ctr、HIF-1αOE、HIF-1αOE+GLS2KD、HIF-1αOE+H2O2五组Lovo细胞48h后,CCK8检测细胞增殖活性。第四部分（1）免疫组化法检测结直肠癌术后108例组织标本（其中23例含癌旁黏膜组织）中HIF-1α和GLS2的表达,并分析二者的表达与临床病理参数的相关性;（2）采用Spearman等级相关分析HIF-1α和GLS2的表达之间的相关性,Kaplan-Meier法分析结直肠癌中HIF-1α和GLS2的表达与患者预后的关系,Cox回归模型分析结直肠癌患者预后的影响因素。结果:1、缺氧通过促进HIF-1α的表达参与结肠癌细胞耐药1%O2处理Lovo细胞12h时HIF-1α表达水平最高;OXA或5-Fu处理细胞后,1%O2组的Lovo细胞增殖活性均较20%O2组强;相较于野生型结肠癌细胞株HCT-116和HCT-8,耐药细胞株HCT-116/OXA和HCT-8/5-Fu中HIF-1α和GLS2的表达均增高,而HIF-2α和GLS1无明显变化。2、HIF-1α通过转录调控促进GLS2的表达缺氧时敲低HIF-1α,GLS2的表达随之降低;常氧时过表达HIF-1α,GLS2的表达随之升高;临床数据库ICGC分析发现GLS2和不同HIF-1α靶基因之间的表达存在明显正相关;基因数据库TRANSFAC MATRIX TABLE分析GLS2启动子序列与HIF-1α靶基因序列的相似度为99.8%;荧光素酶报告基因发现HIF-1α能够启动GLS2的转录,同时将GLS2的启动子序列突变以后HIF-1α对其的启动活性随之下降。3、HIF-1α通过提高GSH水平促进结肠癌细胞耐药过表达HIF-1α时GSH水平升高,敲低GLS2后GSH水平随之下降;OXA或5-Fu处理细胞后,过表达HIF-1α时细胞增殖活性增强,但在加入H2O2或敲低GLS2后,细胞的增殖活性随之下降。4、HIF-1α和GLS2在结直肠癌中的表达及临床意义结直肠癌组织中HIF-1α和GLS2的表达均明显高于癌旁黏膜组织,且差异具有统计学意义（P<0.01）。其中,HIF-1α的表达与年龄、TNM分期、淋巴结转移、术后远处转移有关（P<0.05）,而GLS2的表达则与年龄、浸润深度、术后远处转移有关（P<0.05）。同时,HIF-1α和GLS2的表达呈显著正相关（r=0.464,P<0.01）,且二者均与结直肠癌患者的预后有关;Cox回归分析也显示TNM分期、术后远处转移、HIF-1α、GLS2均是结直肠癌预后的独立影响因素（P<0.05）。结论:HIF-1α作为重要的转录因子,缺氧时其表达明显增高,且与结肠癌耐药密切相关,它通过转录调控GLS2的表达,促进GSH的合成进而引起结肠癌细胞的化疗耐药;同时结直肠癌患者中HIF-1α、GLS2高表达组的预后均比低表达组的差,提示二者可能在结直肠癌的发生、发展中起着重要的作用。