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2,3-丁二醇(2,3-butanetriol,简称2,3-BD)及其衍生物是一种重要的生物基化学品,它在化工、食品、医药、燃料和航空等多个领域有广泛应用。由于传统化学法合成2,3-丁二醇具有成本高,工艺复杂且污染严重诸多缺点。因此,选择由微生物发酵可再生的生物质原料,且反应条件温和、生产过程安全、符合绿色化工要求的生物法生产2,3-丁二醇成为了国内外的研究热点。产酸克雷伯氏菌(Klebisella oxytoca)作为2,3-丁二醇的产生菌,具有适应环境能力强、底物范围广、代谢彻底、副产物较少、产物浓度和转化率较高等优点,被认为是有工业化生产前景的菌株。但是,酸性副产物乳酸和乙酸的积累是限制2,3-丁二醇产量提高的主导因素,发酵过程中乳酸和乙酸含量的增加,会抑制菌体的生长,不但降低了2,3-丁二醇的产量,同时增加了后续对2,3-丁二醇分离纯化的复杂性。ldh和ack基因分别编码的乳酸脱氢酶和乙酸激酶是乳酸、乙酸代谢途径的关键酶,本研究利用λRed同源重组技术对K.oxytoca HD79中ldh和ack基因逐个敲除,先后阻断乳酸和乙酸的生成途径,促使碳流量更多流向2,3-丁二醇,希望获得高产2,3-丁二醇工程菌。本研究第一阶段利用实验室保藏的具有产2,3-丁二醇能力的菌株K.oxytoca HD79作为出发菌株,利用PCR技术,以K.oxytoca HD79基因组DNA为模板,克隆出两段分别为489 bp和400 bp ldh基因的同源序列;以质粒pGP704-Cm为模板,扩增出一段长为876 bp氯霉素抗性基因(Cm~r)序列。采用酶切连接的方式进行体外拼接,将Cm~r基因插入于ldh目的基因片段内部,构建同源重组序列ldhL-Cm~r-ldhR;通过λRed同源重组筛选敲除成功的重组菌株K.oxytoca HD79-01,并采用PCR、qRT-PCR、SDS-PAGE、ldh酶活力测定以及2,3-丁二醇产量等指标进一步验证重组菌株。结果表明原始菌株K.oxytoca HD79的ldh酶活力(0.254±0.01U/mg)比重组菌株K.oxytoca HD79-01的ldh酶活力(0.112±0.02 U/mg)下降了55.9%。K.oxytoca HD79的2,3-丁二醇产量31.71 g/L、转化率0.34 g/g和生产强度0.33 g/L·h;K.oxytoca HD79-01的2,3-丁二醇产量40.20 g/L、转化率0.38 g/g和生产强度0.48 g/L·h;后者较前者分别提高了26.8%、11.8%和45.5%;而乳酸则由4.83 g/L下降到2.45 g/L,后者较前者降低了49.3%。本研究第二阶段利用已构建的ldh缺失重组菌株K.oxytoca HD79-01作为出发菌株,利用PCR技术,以K.oxytoca HD79-01基因组DNA为模板,克隆出两段分别为308 bp和312 bp ack基因的同源序列;以质粒pET-28a(+)为模板,扩增出一段长为813 bp卡那霉素抗性基因(Kan~r)序列。采用酶切连接的方式进行体外拼接,将Kan~r基因插入于ack基因片段内部,构建同源重组序列ackL-Kan~r-ackR;通过λRed同源重组筛选敲除成功的重组菌株K.oxytoca HD79-02,同样采用PCR、qRT-PCR、SDS-PAGE、ack酶活力测定以及2,3-丁二醇产量等指标验证重组菌株。结果表明原始菌株K.oxytoca HD79的ack酶活力(0.233±0.003 U/mg)比重组菌株K.oxytoca HD79-02的ack酶活力(0.062±0.02 U/mg)下降了73.4%。K.oxytoca HD79的2,3-丁二醇产量29.83 g/L、转化率0.39 g/g和生产强度0.31 g/L·h;K.oxytoca HD79-02的2,3-丁二醇产量46.21 g/L、转化率0.47 g/g和生产强度0.64g/L·h;后者较前者分别提高了54.9%、20.5%和106.5%;而乳酸和乙酸则分别由4.94 g/L和4.28 g/L下降到2.45 g/L和1.59 g/L,后者较前者分别降低了48.2%和62.8%。本课题所成功构建的ldh和ack缺失重组菌株K.oxytoca HD79-02和原始菌株K.oxytoca HD79相比2,3-丁二醇的产量、转化率和生产强度分别提高54.9%、20.5%和106.5%,对构建2,3-丁二醇高产菌株有一定指导意义。同时,也为2,3-丁二醇的工业化生产扩大了菌株选择。