[目的]两栖动物作为水生鱼类到陆生脊椎动物的一个过渡类群,在生物进化中占据重要的生物学地位。为了适应环境,物种的进化方向多种多样,产毒动物就是其中一种,在水生鱼类和陆生脊椎动物中都有产毒动物的分布,而两栖动物由于毒液输送机制的缺失通常只被认为是有毒动物而非产毒动物,这似乎是一种进化缺失现象。此外,两栖动物由于皮肤中有丰富的腺体分泌系统,被广泛关注和研究,然而这些研究大多集中于对其皮肤分泌物中天然生物活性肽资源的开发和探索,对于皮肤分泌物在两栖动物自身适应环境过程中的生物学作用尚缺乏系统性的研究和阐述。本课题旨在系统性地研究云南臭蛙皮肤分泌物和上颌齿的生物学功能,探讨云南臭蛙是否可以被定义为产毒动物,以及解释云南臭蛙皮肤分泌物在其适应环境过程中的生物学作用,并对分泌物中的促创伤修复肽进行进一步分离纯化和功能探索。[方法]野外采集云南臭蛙成体,并通过电刺激收集足够量皮肤分泌物后,以扫描电镜以及石蜡切片染色等形态学分析方法对云南臭蛙皮肤结构以及腺体分布进行分析,同时通过石蜡切片染色对云南臭蛙上颌齿进行结构分析。此外,通过SDS-PAGE和HPLC对分泌物的组成进行分析,然后对蛋白部分进行碱性蛋白酶活性检测,同时通过毒性检测、反捕食能力检测,抗氧化活性检测、抑菌性检测,及整体动物水平促修复活性检测等,对皮肤分泌物在云南臭蛙生存活动中的生物学作用进行分析。在确定云南臭蛙皮肤分泌物可以促进皮肤创伤愈合后,通过HPLC对分泌物中的促修复小分子部分进行分离纯化,并对各分离峰以细胞划痕实验追踪细胞水平促创伤修复活性追踪,并对追踪到的活性多肽进行一级结构测定,同时构建皮肤cDNA文库,对多肽序列进行商业合成后,对样品进行急性毒性检测、溶血试验、体外自由基清除活性检测、抗菌性检测、稳定性分析,以及通过体外细胞划痕实验、细胞增殖检测和动物水平小鼠全皮层损伤修复试验检测样品促创伤修复能力,并对动物模型进行H&E染色,观察分析其促创伤修复过程中新生表皮和肉芽组织的形成情况。[结果](1)云南臭蛙皮肤真皮疏松层有颗粒腺和粘液腺分布,且各部位腺体分布不同:体积较大的颗粒腺在头部皮肤以及背部皮肤;(2)云南臭蛙皮肤表面有两种腺体外排开口:1型开口有瓣膜状结构,2型开口为不规则圆形;(3)云南臭蛙皮肤分泌物中含有大量蛋白、多肽类化合物,其蛋白部分有碱性蛋白酶活性,且皮肤分泌物具有致死毒性;(4)云南臭蛙上颌齿与前颌骨和上颌骨直接相连,可以分为a型和b型,a型为中空圆锥状,b型为实质骨刺状;(5)皮肤分泌物具有细胞毒性、溶血活性、皮下注射后可引起急性疼痛和水中反应;(6)皮肤分泌物有一定反捕食效果;(6)皮肤分泌物具有抗氧化能力、抗菌性和促创伤修复活性;(7)从分泌物中筛选鉴别出了一条结构新颖、活性较强的天然促创伤修复肽:OA-GL21,一级结构为“GLLSGHYGRVVSTQSGHYGRG”,相对分子量为2188.0 Da;(8)OA-GL21对小鼠无急性毒性、无溶血活性、有一定体外自由基清除活性、无抗菌性,稳定性较强;(9)OA-GL21促进皮肤角质细胞和皮肤成纤维细胞划痕愈合,对细胞增殖无明显影响;(10)OA-GL21促进小鼠皮肤创伤愈合,并且有抑制瘢痕增生,减少疤痕形成的潜力。[结论](1)云南臭蛙可被视为产毒动物,其皮肤分泌物可被定义为动物毒液且上颌齿可作为毒液输送工具,由此推测其他具有上颌齿等类似结构的有毒蛙类也可被视为产毒动物;(2)云南臭蛙皮肤分泌物可以作为一种化学武器,有助于云南臭蛙有效捕食与防御,参与捕食-反捕食活动,抵御其他物种侵扰,保护皮肤免受氧化损伤,抵御微生物侵袭以及促进皮肤创伤愈合,是一种有效的生存策略;(3)云南臭蛙皮肤分泌物中含有促创伤修复肽,能够为新型促创伤修复药物研发提供大量分子模板。