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目的:克隆人颗粒溶素(granulysin)基因cDNA，构建颗粒溶素原核表达载体并进行表达，纯化大肠埃希菌表达的谷胱苷肽巯基转移酶(GST)-颗粒溶素融合蛋白，并检测其体外抗菌活性。
方法:1.用结核分枝杆菌抗原(Mtb-Ag)刺激人外周血单个核细胞(PBMC)，加IL-2扩增11d获得Mtb-Ag激活的T细胞(MtbAT)细胞，收集细胞提取总RNA，采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术从MtbAT细胞获得颗粒溶素cDNA，PCR产物经凝胶电泳、割胶回收后，克隆入载体pCDNAⅡ中，形成重组载体pCDNAⅡ-granulysin。筛选出阳性克隆，通过限制性内切酶酶切鉴定后对其进行测序。2.取测序正确的重组载体pCDNA Ⅱ-granulysin再克隆到原核表达质粒pGEX4T-1中，构建重组表达载体pGEX4T-1-granulysin，筛选出阳性克隆后通过限制性内切酶酶切鉴定。3.取pGEX4T-1-granulysin转化大肠埃希菌BL21，用IPTG诱导GST-颗粒溶素融合蛋白表达，将诱导处理后的细菌破碎，并用SDS-PAGE鉴定，分离含有可溶性GST-颗粒溶素融合蛋白的细菌裂解液，并通过GSH-琼脂糖珠亲和层析柱纯化。4.四甲基噻唑氮蓝(MTT)法检测该纯化蛋白对大肠埃希菌BL21、金黄色葡萄球菌Cowan I株、甲型溶血性链球菌S34Sr株、伤寒沙门菌0901株抗菌活性。
结果:1.PBMC经Mtb-Ag刺激，扩增获得大量MtbAT细胞，其中γδT细胞占77.62％。从MtbAT细胞总RNA中扩增得到438bp的目的片段。2.核苷酸序列分析显示其cDNA序列与GenBank中颗粒溶素基因编码序列基本相同，仅发现编码119位氨基酸的ACC向ATC改变，其编码的氨基酸由苏氨酸(T)变成了异亮氨酸(I)。 3.含重组表达载体pGEX4T-1-granulysin的大肠埃希菌BL21经IPTG诱导后，SDS-PAGE显示出一条相对分子量(Mr)为44kD的蛋白条带，采用亲和层析法可获得分子量为44 kD的单一蛋白条带。4.抗菌活性分析，纯化产物对金黄色葡萄球菌Cowan I株的抑菌率可达到75.47％，对甲型溶血性链球菌S34Sr株的抑菌率可达到86.75％，而对伤寒沙门菌0901株和大肠埃希菌BL21的抗菌活性不明显抑菌率仅为38.63％和30.91％。
结论:成功构建颗粒溶素基因的克隆载体和GST融合表达载体，诱导并纯化颗粒溶素与GST的融合蛋白，该蛋白对革兰阳性菌具有高效抗菌活性。