水稻粒型基因SRG的初步功能分析及苗期白条纹叶基因GARS的图位克隆与功能分析

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本文共分为两个部分,第一部分为水稻粒型基因SRG的精细定位及初步功能分析,第二部分为水稻苗期白条纹叶基因GARS的图位克隆与功能分析。第一部分:水稻粒型不仅影响水稻的产量,同时也影响稻米的外观品质。本研究从粳稻品种Dongjin组织培养的后代中筛选到一个矮杆小粒突变体srg,通过精细定位与功能分析,初步揭示了SRG调控水稻株高及籽粒发育的分子机制,为进一步完善水稻籽粒发育调控网络及育种利用奠定了基础。主要结果如下:srg突变体较野生型表现出株高变矮、籽粒变小、叶夹角变小等表型。通过对野生型和突变体茎秆及颖壳扫描电镜观察,发现突变体中细胞数目没有明显变化,细胞长度变小。对野生型及突变体中细胞壁及细胞伸长相关基因进行定量分析,发现它们大都显著下调表达。上述结果表明,细胞变小是导致突变体表型出现的主要原因。遗传分析结果显示srg突变表型由单隐性核基因控制,将突变体与籼稻品种N22进行杂交,构建F2定位群体,通过精细定位,将其定位在第6染色体短臂174 kb区间内。测序发现,第4个ORF的编码区发生一个单碱基的突变,导致一个氨基酸的变化。对该基因进行CRISPR敲除,敲除株系出现突变体的表型,结果表明ORF4很可能就是控制水稻粒型的基因SRG。通过蛋白序列比对及Motor结构域进化树分析,发现SRG基因编码一个驱动蛋白(kinesin),属于kinesin-10家族。组织表达分析表明,SRG基因呈组成性表达,并且在幼穗中表达量最高。外源BL处理发现srg突变体是一个BR弱敏感突变体,对BR信号途径相关基因定量分析,发现突变体中BR信号途径的关键基因OsBRT1、MDP、BLE1和OsBU1均表达下调,提示SRG可能通过BR信号途径影响水稻生长发育。第二部分:叶绿体是植物特有的细胞器,是植物进行光合作用的主要场所,为植物的生长发育提供能量和物质基础。植物叶绿体发育是一个非常复杂的过程,其中任何一个相关基因发生突变,均会引起叶绿体发育出现异常,导致叶色表型的出现。本研究从籼稻品种南京11 EMS诱变的突变体库中,筛选得到一个苗期白条纹叶突变体gars,通过图位克隆与功能分析,初步阐释了GARS基因在水稻早期叶绿体发育过程中的重要作用。主要结果如下:与野生型相比,突变体从第2叶开始,新生叶片表现为白化,之后自叶片顶端开始逐渐转绿,出现白绿相间的条纹表型。到5叶期时,新长出的叶片已经表现为正常绿色表型。叶绿素含量测定结果与上述表型观察结果吻合。通过对叶绿体超微结构观察,发现突变体中叶绿体类囊体片层结构明显减少,淀粉颗粒变小,嗜锇体明显增多,显示突变体叶绿体早期发育出现异常。遗传分析结果显示gars突变表型由单隐性核基因控制,将突变体与粳稻品种Dongjin进行杂交,构建F2定位群体,通过精细定位,将其定位在第8染色体短臂84 kb区间内,共有7个ORF。测序发现,第1个ORF的编码区发生一个单碱基突变,导致一个氨基酸的变化。通过转基因互补及CRISPR敲除的转基因阳性植株表型结果验证,表明ORF1就是控制水稻苗期白条纹叶基因GARS。该基因编码一个甘氨酰胺核苷酸合成酶,负责催化嘌呤从头合成的第2步反应。酶活性测定结果显示,突变体中GARS酶活性较野生型显著降低。此外,对野生型和突变体中的核苷酸含量进行了测定,发现突变体中ATP、ADP、AMP、GTP、GDP的含量都有所下降,其中ATP含量下降最为明显。qRT-PCR结果表明,GARS是一个组成性表达的基因,其中在叶片中的表达量最高。亚细胞定位结果显示,GARS蛋白定位在叶绿体。通过对叶绿素合成及叶绿体发育关键基因进行荧光定量分析和western blot分析,结果表明突变体中叶绿素合成基因表达量发生明显改变,质体中由PEP负责转录的基因及蛋白表达量均明显下降。
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