十二指肠贾第虫组织蛋白酶L的克隆表达及对巨噬细胞炎症反应的影响

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十二指肠贾第虫(Giardia duodenalis,简称贾第虫)是一种与胃肠道疾病有关的人畜共患病原体,在全球范围内广泛分布,每年大约有2亿人感染贾第虫。贾第虫生活史仅有两个阶段,包括可导致疾病产生的滋养体阶段和可长期抵抗外界不良环境的包囊阶段。贾第虫滋养体利用腹吸盘吸附在十二指肠和近端空肠的黏膜上并以二分裂的方式进行增殖。贾第虫的主要通过水源性传染,直接饮用或食用了含有包囊的水和食物即可引起贾第虫感染。贾第虫感染能够导致腹泻、体重减轻和腹部胀气等临床症状,以及关节炎、肠易激综合征和慢性疲劳综合症等多种并发症。贾第虫是最原始的单细胞真核生物,作为真核生物研究模型具有重要的研究价值。组织蛋白酶是半胱氨酸蛋白酶家族的重要组成部分,在各种动物的组织和细胞内广泛存在,并且因其具有多种生物学功能而被广泛研究。随着研究的不断深入,发现组织蛋白酶在多种生物学过程中发挥重要作用,如抗原加工和提呈、细胞凋亡、肿瘤进展和转移、骨吸收和骨溶解、寄生虫感染、组织侵袭和再生、免疫逃避等方面。组织蛋白酶L是组织蛋白酶家族中的一员,具有很强的内肽酶活性,其降解蛋白和细胞外其他成分的作用与其他蛋白酶相比更加强大。组织蛋白酶L主要参与机体中的蛋白的降解、抗原加工、抗原呈递、肿瘤细胞的入侵和转移等过程。在对寄生动物的研究中发现,组织蛋白酶L主要在寄生动物的营养摄取、细胞或组织入侵、免疫逃逸、个体发育及组织分化等方面发挥重要作用。所以对寄生动物组织蛋白酶L的研究不仅有利于揭示寄生动物与宿主相互作用的机制,同时也为寄生动物疾病的防治开辟了新的思路和视野。本研究选取十二指肠贾第虫组织蛋白酶L(CTSL-1、CTSL-2和CTSL-3)基因,运用生物信息学技术分析预测其亲疏水性、信号肽、结构域、二级结构和三级结构。本研究根据三种组织蛋白酶L的基因序列设计引物,以贾第虫全基因组序列为模板成功扩增获取CTSL-1、CTSL-2和CTSL-3目的基因。利用p Cold载体和p Cold-TF载体成功构建重组表达质粒p Cold-CTSL-1、p Cold-CTSL-2、p Cold-CTSL-3、p Cold-TF-CTSL-1、p Cold-TF-CTSL-2、p Cold-TF-CTSL-3。成功表达获得包涵体重组蛋白CTSL-1、CTSL-2、CTSL-3和可溶性重组蛋白CTSL-TF-1、CTSL-TF-2、CTSL-TF-3。利用重组蛋白CTSL-1、CTSL-2和CTSL-3三次免疫小鼠制备多克隆抗体。利用蛋白质印迹法(Western Blot)和酶联免疫吸附试验(ELISA)对多克隆抗体进行检测分析,结果显示制备的多克隆抗体具有良好的抗原特异性与优异的抗原结合活性。利用间接免疫荧光技术(IFA)发现组织蛋白酶L广泛分布于贾第虫滋养体胞质内。我们利用三种不同浓度的可溶性重组蛋白刺激巨噬细胞J774A.1,利用一氧化氮测定试剂盒对细胞上清中的一氧化氮水平进行检测,同时利用实时荧光定量PCR检测细胞因子IL-1β和TNF-α的水平。试验结果显示十二指肠贾第虫组织蛋白酶L刺激巨噬细胞后一氧化氮分泌水平均有升高,细胞因子IL-1β和TNF-α的表达情况均上升,且呈现浓度依赖效应。结果表明,CTSL-1、CTSL-2和CTSL-3蛋白能够通过刺激巨噬细胞一氧化氮和促炎症因子IL-1β、TNF-α的分泌来诱导炎症反应。本研究试图揭示贾第虫组织蛋白酶L在贾第虫作用宿主细胞时发挥的功能,这将对贾第虫防治及其疫苗的研发具有重要意义。
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