研究背景和目的主动脉瓣钙化及其进展导致的钙化性主动脉瓣狭窄与关闭不全是一种严重危害人类健康的疾病,随着人口老龄化、生活水平的提高、平均寿命的延长,其发病率呈不断上升趋势。目前认为,瓣膜钙化并非简单的钙磷被动沉积过程,而是类似动脉粥样硬化,由多种细胞和信号蛋白介导的主动性调控病理过程。主要发病机制包括：内皮细胞损伤、脂蛋白沉积、慢性炎症反应、细胞外基质重构等。然而,目前对于钙化性主动脉瓣膜病(calcific aortic valve disease,CAVD)尚无有效的药物干预措施,手术或介入治疗换瓣仍是治疗首选。由于患者年龄普遍较大,且多合并有高血压、糖尿病等其他基础疾病,无疑增加了手术风险。因此,对主动脉瓣钙化发病机制进行深入探讨,寻求新的防治策略迫在眉睫。内质网应激(endoplasmic reticulum stress, ER stress)是由于各种病理性刺激如钙调节异常、同型半胱氨酸代谢及氧化应激过程出现紊乱,引起的内质网应激级联反应,主要包括蛋白质合成暂停,内质网应激蛋白表达和细胞凋亡三个主要过程。内质网应激广泛存在于神经退行性病变、血管粥样硬化及血管钙化等疾病的病理过程,且本课题组前期实验证明内质网应激在瓣膜钙化的过程中具有明显的促钙化作用。终末期氨基糖基化受体(receptor for advanced glycation end products, RAGE)激活后可导致内质网应激反应在上皮细胞的相关研究中已被证实,淀粉样蛋白β(Amyloid β,Aβ)作为RAGE的配体,能够刺激RAGE受体并激活其下游的炎症相关信号通路,相关研究证明在动脉粥样硬化的血管以及钙化瓣膜组织中均发现Aβ蛋白的存在。因此,我们推测在钙化瓣膜中Aβ能够通过激活RAGE受体诱导内质网应激反应从而发挥促钙化作用。在本研究中,我们为了明确Aβ/RAGE通路激活后能否通过诱导内质网应激反应促进主动脉瓣钙化开展了以下工作。首先,通过对比人与动物钙化瓣膜中Aβ/RAGE通路与内质网应激相关蛋白表达的差异,确定上述过程在瓣膜钙化过程中是否激活;其次,构建双敲基因动物模型,观察特异性敲除小鼠RAGE基因后Aβ/RAGE通路、内质网应激、成骨及炎症相关因子表达的差异；第三,在体外实验中通过构建原代瓣膜问质细胞钙化模型,并予以各种不同干预,利用免疫蛋白印迹、免疫组化等分子生物学技术,详细阐述Aβ/RAGE通路、内质网应激及瓣膜钙化三者之间相互作用机制。实验方法与结果体内实验设计：取CAVD患者瓣膜作为钙化组。急性主动脉夹层行Bentall手术患者瓣膜作为对照组进行组织学切片染色,所有涉及人体标本均符合医学伦理学要求,经过华中科技大学伦理委员会批准且通过患者知情同意并签字。与对照组瓣膜相比,钙化组瓣膜组织内皮缺损并出现成纤维细胞样改变,成骨因子BMP2和Runx2表达增多。内皮是瓣膜的第一道屏障,成纤维样改变通常被认为是正常瓣膜向瓣膜钙化的过渡状态,瓣膜的成骨分化是导致钙化的最重要因素。因此,上述结果成功验证所取钙化组瓣膜符合钙化瓣膜特点。同时,Aβ、RAGE受体与内质网应激相关蛋白C/EBP homologous protein(CHOP)和protein kinase-like ER kinase(PERK)的表达在钙化组瓣膜中均上调,提示上述蛋白可能参与到瓣膜钙化的过程,且免疫荧光染色证实Ap与RAGE受体特异性结合,说明Aβ能通过RAGE受体发挥作用。动物实验中正常对照组选用C57/B6J背景小鼠,瓣膜钙化造模组选用ApoE-/-小鼠,干预组选用ApoE-/-RAGE-/-双敲基因小鼠。各组小鼠均选取8周龄,体重30g左右雄性小鼠。小鼠进入SPF培养室后先给予正常饮食1周,待小鼠适应环境且行心脏彩超检查无异常后,三组均开始给予西式饮食喂养。上述西式饮食及ApoE-/-小鼠由北京华阜康公司提供；ApoE-/-RAGE-／-双敲除小鼠的构建由南京大学模式动物中心提供技术支持；SPF级动物实验室由华中科技大学实验动物中心提供。Control组、ApoE-/-组和ApoE-/-RAGE-/-组三组动物模型均于西式饮食干预前以及干预24周之后,在异氟烷(2.5%)全麻下行超声检测。超声设备型号为GE-vivid 7,探头频率采用18-38MHz。从SPF级动物实验室领出小鼠前,提前12小时给予小鼠禁食禁水处理,防止饮食饮水对后续血糖血脂检测结果的干扰。小鼠用脱毛膏脱毛后置于麻醉罐中,当小鼠心率缓慢降至300-350bpm范围时经胸行超声检测,主要收集主动脉瓣口血流速度、主动脉瓣口直径及小鼠心功能相关指标,主动脉瓣膜开口面积(AVA)的计算方法参照连续方程法,所有超声数据由同一超声科医师收集。与Control组相比,ApoE-/-组超声显示主动脉瓣口峰速明显增高,最高值可达20mm/s;形态学染色显示瓣膜形态增厚明显,且茜素红染色显示钙结节所占培养板比例明显增多；免疫组化检测显示BMP2与Runx2表达明显增高；内质网应激相关蛋白CHOP与PERK明显上调。上述结果均说明西式饮食成功诱导ApoE-/-小鼠瓣膜钙化,且内质网应激可能在瓣膜钙化过程中发挥作用,本部分结果与人体标本中上述指标的改变相一致。与ApoE-/-组相比,ApoE-/-RAGE-/-组心脏超声检测显示主动脉瓣口峰速明显降低；形态学染色可见瓣膜形态增厚不明显,且钙结节比例明显下降；免疫组化检测BMP2与Runx2表达明显减少；内质网应激相关蛋白CHOP和PERK明显下调；巨噬细胞标记物CD68表达减少。上述结果提示,特异性敲除RAGE基因延缓了小鼠主动脉瓣膜钙化的进展,抑制了内质网应激反应及炎症细胞浸润。我们进一步检测ApoE-/-RAGE-/-组小鼠血糖血脂代谢情况,与ApoE-/-组相比数据无统计学差异。上述结果进一步提示RAGE基因敲除延缓瓣膜钙化的过程与血糖血脂的改变无关,我们推测可能是通过抑制内质网应激反应、成骨分化以及炎症反应实现。Ap/RAGE通路、内质网应激反应与瓣膜钙化相互影响的机制将在体外实验中进行阐述。细胞实验部分：对照组瓣叶取自急性主动脉夹层行Bentall术者。采用胶原酶消化法获得原代瓣膜间质细胞,选用2-5代细胞进行实验干预。在不同浓度梯度Aβ40(0μM, 25μM,50μM,100μM)干预下对主动脉瓣膜间质细胞(aortic valve interstitial cells,AVICs)进行孵育,通过钙化培养基建立体外钙化模型,观察RAGE受体与成骨蛋白的表达,结果显示RAGE受体、BMP2与Runx2的表达随Aβ40浓度的递增而增加。通过siRNA干扰技术抑制RAGE受体的表达,免疫蛋白印迹结果显示Aβ40诱导BMP2与Runx2表达的作用明显减弱；Aβ40诱导内质网应激相关蛋白CHOP与PERK的表达也明显减少。上述结果表明AP40/RAGE通路作为上游蛋白分子能够诱导成骨因子表达以及内质网应激反应。下一步将探讨成骨因子的表达与内质网应激相互作用的机制。取不同时间点,采用Aβ40 (50μM)对细胞进行孵育,观察ERK1/2、NF-κB和p38 MAPK蛋白磷酸化程度,免疫蛋白印迹显示ERK1/2和NF-κB的磷酸化程度在一定时间内随Aβ40干预时间增加而增加,p38 MAPK磷酸化程度无明显改变。ERK1/2和NF-κB磷酸化能诱导成骨因子及炎症因子的表达,因此我们推钡Aβ40/RAGE通路通过激活内质网应激产生级联反应促进ERK1/2与NF-κB磷酸化,进而影响瓣膜钙化。为了验证这一推测,我们通过内质网应激特异性抑制剂Tauroursodeoxycholic acid (TUDCA)干预细胞,在Aβ40孵育下观察ERK1/2与NF-κB磷酸化程度,免疫蛋白印迹结果显示随TUDCA浓度增高,Aβ40诱导的ERK1/2与NF-κB磷酸化水平递减。通过ERK1/2与NF-κB磷酸化特异性抑制剂PD 98059与BAY 11-7082抑制剂干预,观察BMP2与Runx2蛋白的表达,免疫蛋白印迹结果显示BMP2与Runx2的表达受到不同程度的抑制。上述结果提示Aβ40/RAGE通路能够诱导内质网应激反应并产生级联反应,激活ERKl/2与4F-κB磷酸化最终改变成骨因子的表达。通过siRNA干扰技术,抑制RAGE受体的表达,实时定量PCR结果显示Aβ40诱导IL-1β、TNF-α和MCP-1基因表达的效应显著降低。说明Aβ40/RAGE通路诱导产生的免疫炎症反应可能参与到瓣膜钙化的过程。结论本实验中,我们首先证实了CAVD患者主动脉瓣与动物瓣膜钙化模型中Aβ40/RAGE通路与内质网应激反应被激活；与造模组相比,在动物体内特异性敲除RAGE基因后瓣膜钙化程度及内质网应激反应均减轻。体外实验则进一步证明Aβ40与RAGE受体,内质网应激反应及成骨分化之间的相互作用机制。本文详细阐述了Aβ40/RAGE通路诱导内质网应激反应并产生级联反应,激活ERK1/2与NF-κB磷酸化并最终改变成骨因子表达的过程。