论文部分内容阅读
目的:使用干扰素（Interferon,IFN）进行抗病毒治疗可显著提高部分核苷经治的慢性乙型病毒性肝炎（Chronic Hepatitis B,CHB）患者的临床治愈率,且对IFN应答佳的患者血浆外泌体能显著抑制乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus,HBV）的复制,另有研究显示抑制自噬相关基因可以抑制HBV病毒复制。本研究旨在深入探讨干扰素作用下,巨噬细胞外泌体中的微小RNA（Micro RNA,miRNA）对肝细胞自噬及HBV复制的影响和分子机制,进一步揭示干扰素发挥抗病毒作用的机制。方法:选取核苷类似物（Nucleotide Analogs,NAs）经治、HBV DNA阴性且乙肝表面抗原（Hepatitis B Surface Antigen,HBs Ag）＜3000 IU/m L的慢乙肝患者,采用聚乙二醇干扰素α（Pegylated IFN-α,Peg IFN-α）联合恩替卡韦进行治疗。在治疗12周时HBs Ag的水平较基线下降大于0.5 log10 IU/m L的患者定义为应答佳组。选取应答佳组患者治疗基线和12周时的血浆标本,对血浆外泌体进行提取。同时使用干扰素刺激巨噬细胞48小时,对巨噬细胞上清的外泌体进行提取。分别应用透射电镜、蛋白印迹（Western Blot,WB）的方法检测外泌体形态和蛋白标志物,并使用纳米颗粒跟踪分析（Nanoparticle Tracking Analysis,NTA）对其粒径进行鉴定。通过高通量测序,检测应答佳组患者治疗基线与12周时血浆外泌体中差异表达的miRNA,并利用生物信息学方法筛选与细胞自噬通路相关的miRNA。使用实时定量聚合酶链式反应（Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction,q PCR）的方法对应答佳组患者的血浆外泌体,及体外实验IFN作用下巨噬细胞上清外泌体中miRNA的表达差异进行验证。将Peg IFN-α治疗12周前后患者血浆外泌体,以及巨噬细胞分泌的外泌体分别加入Hep G2.2.15细胞中,使用共聚焦显微镜进行外泌体示踪实验,并检测肝细胞HBV病毒学指标,包括细胞上清HBs Ag、乙肝病毒e抗原（Hepatitis B e Antigen,HBe Ag）、HBV DNA的水平及细胞内HBV共价闭合环状DNA（Covalently Closed Circle DNA,ccc DNA）含量,以评估这两种外泌体的抗病毒能力。使用Western Blot的方法对Hep G2.2.15细胞内自噬标志蛋白LC3 II进行检测,同时在共聚焦显微镜下观察自噬小体的生成情况。进一步利用miR-30a-5p的模拟物mimic、抑制剂inhibitor分别提高或抑制Hep G2.2.15细胞中miR-30a-5p的表达,观察miR-30a-5p对HBV复制及肝细胞自噬的影响。运用生物信息学软件（Starbase、Targetscan及miRDB）对miR-30a-5p的靶基因进行预测。通过q PCR及Western Blot的方法检测miR-30a-5p对自噬相关基因5（Autophagy Related Gene 5,Atg5）表达的影响,采用双荧光素酶报告基因实验验证miR-30a-5p对Atg5基因表达的调控。结果:将Peg IFN-α治疗12周前后患者的血浆外泌体进行miRNA高通量测序,并对结果进行分析和筛选。筛选后的miRNA使用q PCR的方法验证,实验结果显示应答佳组患者血浆外泌体内miR-30a-5p的含量在治疗12周时较基线明显增加。体外实验显示THP-1来源的巨噬细胞在IFN刺激下,其上清外泌体中miR-30a-5p的含量较未有IFN刺激时明显增加。示踪实验显示,患者血浆的外泌体和巨噬细胞上清的外泌体均可以被Hep G2.2.15细胞摄取。与基线血浆外泌体相比,应答佳组患者治疗12周时的血浆外泌体作用于Hep G2.2.15细胞后,肝细胞上清中HBs Ag、HBe Ag、HBV DNA的水平以及胞内HBV ccc DNA的含量明显降低。Western Blot实验显示自噬标志蛋白LC3 II的生成明显减少,共聚焦显微镜观察发现肝细胞自噬小体的生成受到了抑制。体外实验显示,与干扰素刺激前相比,IFN作用48小时后巨噬细胞上清的外泌体能明显降低Hep G2.2.15细胞上清中HBs Ag、HBe Ag、HBV DNA的水平以及胞内HBV ccc DNA的含量,同时也可以抑制肝细胞自噬小体的形成。生物信息学分析显示Atg5为miR-30a-5p调控的潜在靶基因。通过双荧光素酶报告基因实验,结合miR-30a-5p的模拟物mimic、抑制物inhibitor及其对照的转染实验,发现miR-30a-5p能够与Atg5基因非编码区（Untranslated Coding Regions,UTR）的707-714位点结合,抑制Atg5基因的表达,从而抑制肝细胞自噬小体的形成,并发现HBV的复制水平明显降低。结论:实验结果显示,干扰素作用下巨噬细胞外泌体可被肝细胞所摄取,且外泌体内miR-30a-5p表达水平明显增加,并能抑制肝细胞自噬小体生成关键基因Atg5基因的表达,继而抑制HBV的复制。本研究在一定程度上揭示了干扰素抗病毒治疗的新机制,为抗HBV治疗提供潜在的治疗靶点。