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目的:本研究主要在前期工作的基础上,检测TMEFF1在卵巢癌细胞中的表达;构建TMEFF1稳定过表达及抑制表达的细胞系,探讨TMEFF1对卵巢癌细胞恶性生物学行为的影响,探索TMEFF1下游激活的通路,寻找调控TMEFF1的转录因子及相互作用的蛋白,为研究卵巢癌的早期诊断、疗效判断、术后随访以及生物治疗等提供新的思路和途径。研究方法:1.利用Real-time PCR、Western blot检测了TMEFF1在卵巢癌细胞系及正常卵巢细胞中的表达。利用过表达质粒构建TMEFF1过表达的卵巢癌细胞系OVCAR3-TMEFF1-H和ES-2-TMEFF1-H及其对照细胞系OVCAR3-TMEFF1-HMock和ES-2-TMEFF1-H-Mock。通过慢病毒shRNA获得的稳定抑制表达的卵巢癌细胞系CAOV3-TMEFF1-L、SKOV3-TMEFF1-L及其对照细胞系CAOV3-TMEFF1-L-Mock和SKOV3-TMEFF1-L-Mock。通过Real-time PCR、Western blot及免疫细胞化学检测TMEFF1转染前后卵巢癌细胞系TMEFF1的表达变化。通过MTT实验检测差异表达TMEFF1基因前后卵巢癌细胞增殖能力的变化,划痕实验检测细胞迁移能力变化,Transwell实验检测细胞侵袭能力变化,流式细胞实验检测细胞凋亡及细胞周期的变化。2.利用Western blot方法检测TMEFF1基因差异表达前后,MAPK信号通路节点蛋白RAF、p-RAF、MEK、p-MEK、ERK、p-ERK的表达变化,PI3K/AKT信号通路节点蛋白PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT的表达变化,及EMT相关蛋白E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、MMP2、MMP9的表达变化。进一步应用MTT实验、划痕实验、Transwell实验及流式细胞术检测添加通路抑制剂(PD98059,GDC0941)前后过表达TMEFF1的卵巢癌细胞增殖、迁移及侵袭能力的变化,细胞凋亡及细胞周期的改变。3.利用生信网站预测TMEFF1上游的转录因子,通过ChIP实验检测转录因子p53与TMEFF1基因启动子区域直接结合情况。通过siRNA瞬时转染构建差异表达TP53的卵巢癌细胞系。通过Western blot方法检测差异表达TP53后,TMEFF1的表达变化情况。通过蛋白质谱检测卵巢癌细胞系中与TMEFF1互相作用的蛋白,利用免疫共沉淀及免疫荧光共聚焦方法进行验证。结果:1.卵巢癌细胞系CAOV3、SKOV3中TMEFF1 mRNA及蛋白表达高于细胞系ES-2及OVCAR3,而正常卵巢上皮细胞HOSEpiC表达最低。过表达TMEFF1后,卵巢癌细胞系OVCAR3的细胞增殖能力提高,迁移和侵袭能力提高,细胞凋亡减少,细胞G0/G1期缩短,S期及G2/M期延长。而干扰卵巢癌细胞系CAOV3中TMEFF1表达后,细胞增殖能力降低,迁移和侵袭能力降低,细胞凋亡增加,细胞G0/G1期延长,S期及G2/M期缩短。2.过表达TMEFF1后发现MAPK通路中RAF、MEK和ERK的磷酸化比例升高,PI3K/AKT通路中PI3K、AKT的磷酸化比例升高,与EMT相关的N-cadherin、Vimentin、MMP2和MMP9蛋白也均升高,E-cadherin蛋白降低。干扰TMEFF1表达后,RAF、MEK和ERK的磷酸化比例下降,PI3K/AKT通路中PI3K、AKT的磷酸化比例下降,N-cadherin、Vimentin、MMP2和MMP9蛋白也均下降,E-cadherin蛋白升高。加入MAPK或PI3K通路抑制剂后,过表达TMEFF1的卵巢癌细胞系增殖能力、迁移能力和侵袭能力均下降,而细胞凋亡明显增加。3.转录因子p53可以直接结合在TMEFF1启动子区域。干扰TP53基因表达后发现TMEFF1的表达明显下降。蛋白质谱找到TMEFF1的互作蛋白AHNAK,免疫共沉淀验证了二者在卵巢癌细胞中的相互作用,免疫荧光验证了二者在卵巢癌组织及细胞中共定位。结论:1.卵巢癌中TMEFF1的高表达促进了细胞的增殖、迁移和侵袭,抑制了细胞凋亡。2.TMEFF1参与促进EMT的发生,并激活了MAPK通路及PI3K/AKT通路从而促进了卵巢癌细胞的增殖、迁移和侵袭,抑制细胞凋亡。3.卵巢癌中TMEFF1受到上游转录因子p53的转录调控,且TMEFF1与蛋白AHNAK相互作用。