XPD基因的克隆及其在恶性黑素瘤细胞中的表达

来源 :大连医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:luoweitao2007
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背景: XPD是核酸切除修复过程的主要蛋白,因此XPD与肿瘤的关系越来越受到研究者的重视。因此XPD与肿瘤的关系越来越受到研究者的重视。对皮肤恶性黑素瘤基因易感性分子机制的研究表明XPD是皮肤恶性黑素瘤易感的生物标志。DNA修复酶的调控,是预防肿瘤和治疗的关键,HIF-1在参与调控XPD修复中起着重要作用,增加了HIF1和sp1他们重叠的结合位点之间的竞争,紫外线诱导的磷酸化增强了HIF-1蛋白直接结果,而XPD基因启动子取悦的HRE,在编码DNA修复蛋白的基因中,是DNA修复机制的一个关键调节机制。在XPD基因中的DNA修复因子TFIIH存在亚基突变。许多人着色性干皮病患者的致病与XPD点突变R683W有着某种关联。然而,有明显的异质性,有研究对XPD基因中的TFIIH酶功能的突变的效果发现,每一个突变,表现出独特的生化属性。XPD751密码子的Gln/Gln基因型是男性恶性黑素瘤高风险的有意义基因标志,Lys/Gln基因型对预测恶性黑素瘤恶化有重要意义。在本实验中,我们克隆了XPD,构建了pEGFP-N1/XPD及pcDNA3.1(+)/XPD重组表达质粒,并转染至人恶性黑素瘤细胞,观察它们的表达情况及其在恶性黑素瘤细胞内定位,利用MTT检测细胞的增殖力,以讨论XPD对恶性黑素瘤细胞的生物学影响及其可能的功能。目的:克隆XPD基因并探讨其在恶性黑素瘤细胞内的定位及其功能。方法:克隆出人全长XPD cDNA,将该基因构建入pEGFP-N1/XPD质粒,利用脂质体法转染pEGFP-N1/XPD及pcDNA3.1(+)/XPD至人恶性黑素瘤A375细胞,检测XPD蛋白的表达,然后利用GM130和KDEL进行染色,观察基因XPD的细胞定位。细胞增殖力检测使用MTT法。结果:1.培养Hela细胞并进行RNA逆转录,PCR克隆了人全长XPD cDNA,电泳在约1234bp处见条带。2.将XPD基因连入PEGFP载体并测序鉴定,测序结果与GenBank中人XPD进行比对,结果一致。4. XPD在转染细胞中的高表达。5. PEGFP/XPD重组质粒定位于A375细胞内质网中。6.与转染pcDNA3.1(+)组和空白对照组相比,转染pcDNA3.1(+)/XPD组恶性黑素瘤A375细胞数较少,XPDA375细胞的生长被XPD基因抑制。结论:1.从Hela细胞中成功克隆出同源盒基因XPD。2.构建pEGFP-N1/XPD质粒。3.用免疫荧光染色证实XPD基因定位于恶性黑素瘤A375细胞的内质网中。4. A375细胞的生长被XPD基因抑制。
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