【摘 要】
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免疫系统可通过特异性免疫与非特异性免疫发挥免疫防御、监视和自身稳定等功能。机体免疫系统出现异常或免疫能力下降时,均会导致免疫调节功能紊乱,严重时甚至可引发多种免疫相关疾病。因此,维持机体免疫系统的稳定对人体生命健康具有重要意义。海洋中含有丰富的资源,海洋中的多种植物即可作为食品来源,也可作为增强机体免疫的药物。孔石莼是一种大型绿藻,广泛分布于中国东海和南海沿岸,含有丰富的生物活性物质,其中多糖的含
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免疫系统可通过特异性免疫与非特异性免疫发挥免疫防御、监视和自身稳定等功能。机体免疫系统出现异常或免疫能力下降时,均会导致免疫调节功能紊乱,严重时甚至可引发多种免疫相关疾病。因此,维持机体免疫系统的稳定对人体生命健康具有重要意义。海洋中含有丰富的资源,海洋中的多种植物即可作为食品来源,也可作为增强机体免疫的药物。孔石莼是一种大型绿藻,广泛分布于中国东海和南海沿岸,含有丰富的生物活性物质,其中多糖的含量较高,而孔石莼免疫活性多糖的结构以及调节机理尚不清晰,因此,对孔石莼中免疫活性多糖的分子结构及相关调节机制的研究尤为重要。本研究以绿藻孔石莼(Ulva pertusa)为研究对象,采用水提醇沉法提取孔石莼多糖,通过对RAW264.7巨噬细胞增殖活性和吞噬能力的影响筛选出免疫活性最佳的活性多糖片段UPP;确定了UPP的化学成分和分子结构。对UPP的体外RAW264.7巨噬细胞免疫调节和体内环磷酰胺(Cy)免疫抑制小鼠免疫增强作用进行研究;通过itraq技术对Cy免疫抑制小鼠免疫增强作用机制进行探究。同时对孔石莼多糖UPP进行多糖铁(Ⅲ)配合,对UPP-iron(Ⅲ)的体内外免疫调节活性和免疫作用机制进行了深入探究。首先依次采用DEAE-52和Sephacryl S-400分离纯化孔石莼粗多糖,通过紫外光谱法、红外光谱法、HLGPC、GC-MS、一维核磁和二维核磁等方法对UPP的分子结构进行鉴定,结果表明UPP是相对均一的多糖,相对分子量为235.62 k Da,UPP是由Rha、Ara、Xyl、Glc和Gal组成,各单糖的摩尔百分比为51.94%,6.39%,35.95%,2.79%和2.93%。UPP的主链结构为→4)-β-D-Xylp-(1→4)-α-L-Rhap3S(1→3,4)-β-L-Arap(1→3)-α-L-Rhap(1→2,4)-α-L-Rhap(1→4)-α-D-Galp(1→,并含有两个主要支链,→3,4)-β-L-Arap(1→4)-β-D-Glcp3Me(1→4)-β-D-Glcp A(1→连接于1,3,4-β-L-Arap的C3位置,→4)-β-D-Glcp A(1→4)-β-D-Xylp(1→连接于1,2,4-α-L-Rhap的C2位置。采用刚果红试验、扫描电镜、原子力显微镜和X射线衍射等对UPP的形态特征进行分析,结果表明UPP是表面光滑的薄片,各薄片间通过一些细丝相连,不具有三螺旋结构,是由结晶部分和无定形部分共同形成的半结晶聚合物。然后选取筛选出的主要免疫活性多糖片段UPP进行体外细胞实验,发现UPP能显著提高RAW264.7巨噬细胞增殖活性、吞噬能力、分泌NO和细胞因子能力及相关mRNA的表达;通过Cy免疫抑制小鼠模型,研究了UPP增强脾淋巴细胞增殖活性、增强腹腔巨噬细胞功能,恢复小鼠血清溶血素和细胞因子水平、提高小鼠的造血能力等功能。通过itraq蛋白质组学确定了UPP可显著调节Cy免疫抑制小鼠的免疫调节过程和脂代谢过程,二者间存在相关性。同时对UPP的铁配合物UPP-iron(Ⅲ)进行了功能研究。RAW264.7巨噬细胞体外实验发现UPP-iron(Ⅲ)提高巨噬细胞增殖活性、吞噬能力、分泌NO和细胞因子能力及相关m RNA的表达,作用效果强于UPP;Cy免疫抑制小鼠模型实验发现UPP-iron(Ⅲ)可增强脾淋巴细胞增殖活性,腹腔巨噬细胞功能,恢复小鼠血清溶血素和细胞因子水平,并能提高小鼠的补血功能,与UPP相比,UPP-iron(Ⅲ)可以在不影响多糖免疫调节活性的前提下,提高了免疫抑制小鼠的补血能力。Itraq蛋白质组学确定了UPP-iron(Ⅲ)能显著调节Cy免疫抑制小鼠的免疫系统和脂代谢过程,并能显著提高补血相关蛋白的表达。可通过改善补体和凝血级联和吞噬体通路发挥免疫调节作用。本研究从孔石莼中分离纯化出具有免疫调节活性的多糖组分UPP,其分子结构进行表征分析,对UPP进行铁离子(Ⅲ)配合得到UPP-iron(Ⅲ);同时也证明了UPP和UPP-iron(Ⅲ)对RAW264.7巨噬细胞和Cy免疫抑制小鼠模型具有免疫调节活性。并揭示了UPP和UPP-iron(Ⅲ)免疫调节作用的潜在分子机制。
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