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化疗药物在抗肿瘤治疗方面存在诸多局限性，主要表现为多药耐药（multidrugresistance，MDR）和严重的不良反应。引起这个问题的主要原因是多数化疗药物无法准确、高效地到达肿瘤部位发挥药效。脂质体是一种新型的药物载体，因其粒径较小，能自由渗入肿瘤组织，在肿瘤部位聚集，其本身具有一定的被动靶向性。为了提高脂质体的靶向性，使药物准确、高效地递送至肿瘤部位，一些大分子材料常被用作脂质体的修饰材料，多肽就是其中之一。本实验采用薄膜分散法制备得到同时包裹两种抗肿瘤药物阿霉素和5F的脂质体，并用五肽YIGSR修饰脂质体表面，以乳腺癌MCF-7细胞为研究对象，考察该载药脂质体体外细胞毒性以及靶向性。
【目的】:
1.本文以乳腺癌细胞MCF-7细胞表面过度表达的五肽YIGSR受体为靶点，旨在制备YIGSR修饰的同时包裹阿霉素和5F两种抗肿瘤药物的脂质体（YIGSR-DOX-5F-LP）。
2.考察YIGSR-DOX-5F-LP靶向性及体外细胞毒性。
【方法】
本研究利用薄膜分散-后插入法制备YIGSR修饰的同时包裹阿霉素和5F脂质体（YIGSR-DOX-5F-LP）,高效液相法确定了脂质体中阿霉素和5F的保留时间，并应用动态光散射仪（DLS）测定了脂质体的平均粒径大小和电位大小、透射电镜（TEM）考察了脂质体形态大小、超速离心法测定脂质体的包封率，透析法测定脂质体24小时内的释放度。以脂质体混悬液的外观形态及平均粒径的变化初步评价稳定性。采用MTT法测定脂质体对乳腺癌细胞MCF-7的细胞毒性及IC50值。DAPI染色法考察各给药组细胞形态大小及数量变化，流式细胞法测定各组阿霉素制剂对MCF-7细胞凋亡的影响。采用荧光显微镜、流式细胞仪对脂质体的摄取分别进行定性和定量考察。通过小动物荧光成像仪测定荷瘤裸鼠各组织器官（心、肝、脾、肺、肾）及肿瘤部位阿霉素荧光强度，并用高效液相色谱仪测定了各组织中及肿瘤部位阿霉素含量。
【结果】:
1.脂质体中阿霉素和5F的测定方法色谱条件为：色谱柱反相hypersilC18柱(250×4.6mm,5μm)；流动相甲醇：1%冰醋酸水溶液（40:60,V/V）；检测波长为242nm，流速为1.0mL/min，在该色谱条件下，阿霉素和5F分离度良好，保留时间分别为3.7min和7.6min。
2.测得YIGSR-DOX-5F-LP粒径为186.3±2.5nm，Zeta电位为16.17±0.832mV。透射电镜（TEM）观察到脂质体形态为大小均匀的囊泡型球体，阿霉素和5F的包封率分别为88.9±0.42%和85.2±0.38%，载药量分别为6.24%和5.98%。释放度结果显示，在pH7.4的PBS溶液中，脂质体中阿霉素和5F的释放量较少，释放速度缓慢、平稳，阿霉素和5F的释放度约为20%和40%；在酸性条件下（pH分别为6.5、5.5、4.5），阿霉素和5F的释放量增大，释放速度加快，pH越低，释放度越大。YIGSR-DOX-5F-LP放置15天内无分层现象，粒径大小变化不大。
3.体外细胞毒性实验结果显示，YIGSR-DOX-5F-LP对乳腺癌细胞的IC50值为0.2μg/mL，阿霉素-5F脂质体（DOX-5F-LP）、阿霉素脂质体（DOX-LP）、阿霉素溶液（DOX-Sol）和5F溶液（5F-Sol）的IC50值分别为0.312、0.416、0.506和0.624μg/mL；DAPI染色结果显示，与对照组相比，给药组细胞均出现染色质边缘雾状化，核固缩、起皱且YIGSR-DOX-5F-LP给药组最明显。细胞凋亡实验结果显示，DOX-Sol、DOX-LP、DOX-5F-LP以及YIGSR-DOX-5F-LP给药组的细胞凋亡率分别为10.5%、21.3%、27.4%、49.5%。荧光显微镜观察到YIGSR-DOX-5F-LP给药组细胞表面及细胞核内的荧光强度明显强于DOX-Sol、DOX-LP、DOX-5F-LP给药组，其中，DOX-LP，DOX-5F-LP给药组细胞的荧光强度相当且均强于DOX-Sol给药组，而先用100μMYIGSR溶液孵育1h后再给予同等浓度YIGSR-DOX-5F-LP细胞荧光强度变得很微弱。流式细胞仪测得结果显示，各给药组中，YIGSR-DOX-5F-LP给药组荧光强度最强，其次是DOX-LP、DOX-5F-LP给药组。而荧光强度最弱的是YIGSR-YIGSR-DOX-5F-LP给药组，该结果与荧光显微镜下观察到的结果基本吻合。小动物荧光成像实验考察了荷瘤裸鼠心、肝、脾、肺、肾及肿瘤部位的阿霉素荧光强度，结果显示各给药组中荷瘤裸鼠肿瘤部位阿霉素的荧光强度比心、肝、脾、肺、肾等组织器官中的荧光强度强；另一方面，DOX-LP、DOX-5F-LP、YIGSR-DOX-5F-LP给药组中肿瘤部位阿霉素的荧光强度均强于DOX-Sol给药组，其中YIGSR-DOX-5F-LP给药组中肿瘤部位阿霉素的荧光强度最强。高效液相法测得各组荷瘤裸鼠心、肝、脾、肺、肾和肿瘤部位阿霉素含量如下：DOX-Sol给药组11.17%、27.09%、11.61%、13.01%、31.75%、25.35%ID/g；DOX-LP给药组13.88%、25.9%、11.22%、13.4%、23.79%、32.06%ID/g；DOX-5F-LP给药组12.17%、26.96%、10.86%、14.47%、26.84%、32.76%ID/g；YIGSR-DOX-5F-LP给药组12.02%、22.51%、11.43%、10.65%、28.07%、45.87%ID/g。
【结论】:
1.本研究建立了同时测定阿霉素和5F的色谱方法，在该色谱条件下，阿霉素和5F的分离度高，出峰时间短，且其他材料对阿霉素和5F的出峰时间无干扰，该方法简单有效，可用于同时测定阿霉素和5F的含量。
2.本研究运用薄膜分散-后插入法成功制备出五肽YIGSR修饰的同时包裹两种抗肿瘤药物的脂质体，经考察，该脂质体颗粒均匀、包封率高、稳定性良好。
3.体外细胞毒性及细胞凋亡实验表明，与普通阿霉素脂质体及阿霉素溶液相比，YIGSR-DOX-5F-LP的抗肿瘤效果更明显；细胞体外摄取实验、流式细胞仪测荧光强度实验以及小动物荧光成像实验结果都表明该脂质体具有良好的靶向效率。因此，YIGSR修饰脂质体确实可提高脂质体的靶向性，增强药物的抗肿瘤效果。
【目的】:
1.本文以乳腺癌细胞MCF-7细胞表面过度表达的五肽YIGSR受体为靶点，旨在制备YIGSR修饰的同时包裹阿霉素和5F两种抗肿瘤药物的脂质体（YIGSR-DOX-5F-LP）。
2.考察YIGSR-DOX-5F-LP靶向性及体外细胞毒性。
【方法】
本研究利用薄膜分散-后插入法制备YIGSR修饰的同时包裹阿霉素和5F脂质体（YIGSR-DOX-5F-LP）,高效液相法确定了脂质体中阿霉素和5F的保留时间，并应用动态光散射仪（DLS）测定了脂质体的平均粒径大小和电位大小、透射电镜（TEM）考察了脂质体形态大小、超速离心法测定脂质体的包封率，透析法测定脂质体24小时内的释放度。以脂质体混悬液的外观形态及平均粒径的变化初步评价稳定性。采用MTT法测定脂质体对乳腺癌细胞MCF-7的细胞毒性及IC50值。DAPI染色法考察各给药组细胞形态大小及数量变化，流式细胞法测定各组阿霉素制剂对MCF-7细胞凋亡的影响。采用荧光显微镜、流式细胞仪对脂质体的摄取分别进行定性和定量考察。通过小动物荧光成像仪测定荷瘤裸鼠各组织器官（心、肝、脾、肺、肾）及肿瘤部位阿霉素荧光强度，并用高效液相色谱仪测定了各组织中及肿瘤部位阿霉素含量。
【结果】:
1.脂质体中阿霉素和5F的测定方法色谱条件为：色谱柱反相hypersilC18柱(250×4.6mm,5μm)；流动相甲醇：1%冰醋酸水溶液（40:60,V/V）；检测波长为242nm，流速为1.0mL/min，在该色谱条件下，阿霉素和5F分离度良好，保留时间分别为3.7min和7.6min。
2.测得YIGSR-DOX-5F-LP粒径为186.3±2.5nm，Zeta电位为16.17±0.832mV。透射电镜（TEM）观察到脂质体形态为大小均匀的囊泡型球体，阿霉素和5F的包封率分别为88.9±0.42%和85.2±0.38%，载药量分别为6.24%和5.98%。释放度结果显示，在pH7.4的PBS溶液中，脂质体中阿霉素和5F的释放量较少，释放速度缓慢、平稳，阿霉素和5F的释放度约为20%和40%；在酸性条件下（pH分别为6.5、5.5、4.5），阿霉素和5F的释放量增大，释放速度加快，pH越低，释放度越大。YIGSR-DOX-5F-LP放置15天内无分层现象，粒径大小变化不大。
3.体外细胞毒性实验结果显示，YIGSR-DOX-5F-LP对乳腺癌细胞的IC50值为0.2μg/mL，阿霉素-5F脂质体（DOX-5F-LP）、阿霉素脂质体（DOX-LP）、阿霉素溶液（DOX-Sol）和5F溶液（5F-Sol）的IC50值分别为0.312、0.416、0.506和0.624μg/mL；DAPI染色结果显示，与对照组相比，给药组细胞均出现染色质边缘雾状化，核固缩、起皱且YIGSR-DOX-5F-LP给药组最明显。细胞凋亡实验结果显示，DOX-Sol、DOX-LP、DOX-5F-LP以及YIGSR-DOX-5F-LP给药组的细胞凋亡率分别为10.5%、21.3%、27.4%、49.5%。荧光显微镜观察到YIGSR-DOX-5F-LP给药组细胞表面及细胞核内的荧光强度明显强于DOX-Sol、DOX-LP、DOX-5F-LP给药组，其中，DOX-LP，DOX-5F-LP给药组细胞的荧光强度相当且均强于DOX-Sol给药组，而先用100μMYIGSR溶液孵育1h后再给予同等浓度YIGSR-DOX-5F-LP细胞荧光强度变得很微弱。流式细胞仪测得结果显示，各给药组中，YIGSR-DOX-5F-LP给药组荧光强度最强，其次是DOX-LP、DOX-5F-LP给药组。而荧光强度最弱的是YIGSR-YIGSR-DOX-5F-LP给药组，该结果与荧光显微镜下观察到的结果基本吻合。小动物荧光成像实验考察了荷瘤裸鼠心、肝、脾、肺、肾及肿瘤部位的阿霉素荧光强度，结果显示各给药组中荷瘤裸鼠肿瘤部位阿霉素的荧光强度比心、肝、脾、肺、肾等组织器官中的荧光强度强；另一方面，DOX-LP、DOX-5F-LP、YIGSR-DOX-5F-LP给药组中肿瘤部位阿霉素的荧光强度均强于DOX-Sol给药组，其中YIGSR-DOX-5F-LP给药组中肿瘤部位阿霉素的荧光强度最强。高效液相法测得各组荷瘤裸鼠心、肝、脾、肺、肾和肿瘤部位阿霉素含量如下：DOX-Sol给药组11.17%、27.09%、11.61%、13.01%、31.75%、25.35%ID/g；DOX-LP给药组13.88%、25.9%、11.22%、13.4%、23.79%、32.06%ID/g；DOX-5F-LP给药组12.17%、26.96%、10.86%、14.47%、26.84%、32.76%ID/g；YIGSR-DOX-5F-LP给药组12.02%、22.51%、11.43%、10.65%、28.07%、45.87%ID/g。
【结论】:
1.本研究建立了同时测定阿霉素和5F的色谱方法，在该色谱条件下，阿霉素和5F的分离度高，出峰时间短，且其他材料对阿霉素和5F的出峰时间无干扰，该方法简单有效，可用于同时测定阿霉素和5F的含量。
2.本研究运用薄膜分散-后插入法成功制备出五肽YIGSR修饰的同时包裹两种抗肿瘤药物的脂质体，经考察，该脂质体颗粒均匀、包封率高、稳定性良好。
3.体外细胞毒性及细胞凋亡实验表明，与普通阿霉素脂质体及阿霉素溶液相比，YIGSR-DOX-5F-LP的抗肿瘤效果更明显；细胞体外摄取实验、流式细胞仪测荧光强度实验以及小动物荧光成像实验结果都表明该脂质体具有良好的靶向效率。因此，YIGSR修饰脂质体确实可提高脂质体的靶向性，增强药物的抗肿瘤效果。