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金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae Sorokin）是一种昆虫病原菌,在农林害虫生物防治中广泛应用,国内外已有50多种商品制剂注册登记,然而目前国际及国内尚无统一的生产及质量标准,影响和制约真菌制剂的开发和应用。本研究以金龟子绿僵菌IMI330189为目标菌株,研究其孢子制备、贮存及其检测方法标准化,为我国真菌杀虫剂标准化提供参考。主要研究结果如下: （1）金龟子绿僵菌孢子制备标准化研究 通过检测菌种的孢子生长性状,4℃、-15℃、-85℃下贮存3个月菌种均需4h打破休眠,12h后生长基本稳定。点接法和平板法培养金龟子绿僵菌表明,SDAY培养基为最适培养基,其主要指标产孢量分别为5.30×108sp/cm2、2.38×108sp/cm2,显著高于其它培养基,且培养性状稳定。继代培养研究发现,从第7代开始出现产孢量显著下降、菌丝徒长等退化特征,因此确定生产菌种继代培养6代后必须进行复壮。4℃下贮存不同时间菌种生物测定结果表明,30周后东亚飞蝗死亡率下降至87%,因此需对菌株进行移植或复壮处理。 （2）金龟子绿僵菌孢子贮存标准化研究 孢子萌发率检测以涂平板法效果优于喉头喷雾法,且在SDAY标准培养基上培养20～22h萌发率为99.79～99.81%,检测效果最佳。将不同梯度含水量（23.67%、8.57%、6.54%、3.67%）孢子粉以离心管石蜡封装和安培管火焰熔封后在不同温度（室温、4℃、-15℃、-85℃）下贮存,安培管火焰熔封处理优于离心管石蜡封装处理,孢子活率总体随含水量的增加及贮存时间的延长而呈下降趋势,且各处理间P<0.01,差异极显著。根据对数残留定律y=a·e-bt拟合估计孢子失活50%所需时间(T50)和失活90%所需的时间(T90),结果表明:含水量为23.67%的孢子粉在室温下贮存130d全部失活;含水量为8.57%的孢子粉在室温下贮存T50和T90值分别为78.68d及259.51d;含水量为6.54%的孢子粉在室温下贮存T50和T90值分别为106.09d和349.95d;含水量为3.69%的孢子粉对温度耐性最高,在室温下可贮存时间大于18个月,适合贮存短期内使用的孢子粉,-15℃和-85℃下T90值分别为3290.55d和5753.96d,适合贮存需要长期贮存的孢子粉。因此,贮存金龟子绿僵菌孢子粉时,建议采用安培管火焰熔封,并将其含水量降低到<5%。 （3）金龟子绿僵菌对东亚飞蝗生物测定标准化研究 以东亚飞蝗为供试虫进行金龟子绿僵菌室内生物测定,通过龄期选择性试验及不同接种方法、接种浓度、接种量、温度、湿度和光照强度试验,结果表明生物测定标准应为:以3龄蝗蝻为供试虫,接种部位是前胸背板下方,接种方法为油剂点接,接种浓度为1×107～1×108sp/ml,接种剂量为0.1～0.2μl/虫,生测温度T=23～27℃,相对湿度RH=45～75%,光照强度L=2050Lux。 （4）金龟子绿僵菌胞外蛋白酶与毒力相关性研究 在菌株生长温度范围内,随着温度升高,蛋白酶产量增加,而相应的LT50值减小,说明胞外蛋白酶生产水平与毒力之间存在一定的协同性,其回归方程为Y=0.0727x+2.1015,R2=0.8918,可作为一个参考指标对菌种进行初步筛选,但不能完全代替毒力测定而成为菌种质量性状的检测指标。