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鸭疫里氏杆菌病是由鸭疫里氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)感染引起鸭、鹅等禽类的一种急性接触性传染病,是危害世界各国养鸭业最为严重的传染病之一。国外已报道有21个血清型,在国内还发现了 4个新的血清型,目前流行的血清型主要为RA Ⅰ型和Ⅱ型。近年来已有鸭疫里氏杆菌灭活疫苗应用的报道。IgY(immunoglobulin of yolk),即卵黄抗体,是普遍存在于鸟类、爬行动物和两栖类动物体内的重要免疫球蛋白分子之一。IVE-2蛋白是鸭疫里氏杆菌感染鸭后在鸭体内特异诱导表达的一种蛋白。本课题研究目的在于制备一种抗鸭IgY Fc片段的单克隆抗体,并用胶体金标记该单克隆抗体作为示踪物,以IVE-2蛋白作为检测线,建立一种鸭疫里氏杆菌感染的体外快速诊断试纸条,并能区分自然感染鸭与灭活疫苗免疫鸭。本研究的主要研究结果如下:1.抗鸭IgY Fc CH2片段单克隆抗体的制备以实验室保存的pMD-18T-CH1-CH2-CH3-CH4质粒为模板,采用PCR扩增鸭IgY Fc CH2基因片段,大小为288 bp。构建重组质粒pMD-18T-CH2,测序与已知序列一致。构建原核表达质粒pET-28a-CH2和pGEX-KG-CH2,诱导表达融合蛋白His-CH2、GST-CH2,大小分别约为17KDa和37KDa。表达纯化后进行Balb/c小鼠的免疫。经融合和筛选后获得稳定分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株两株,分别命名为2F和6F。两株2F和6F杂交瘤细胞注射小鼠后腹水的效价分别为1:1.024×106和1:5.12×105,腹水纯化后的两株单抗效价分别为13.2×104和1:1.6×104。Westernblot检测结果表明2F株单抗能与鸭、鸡血清反应,但不与猪、兔等哺乳动物血清反应。ELISA检测结果表明2F、6F株单抗均不能与鸭或鸡血清反应。说明所制备的抗鸭IgY FcCH2片段单抗可用于多种禽类IgY的Western blot检测。2.抗鸭IgY Fc CH3CH4片段单克隆抗体的制备用本实验室已获得的融合蛋白GST-CH3CH4免疫小鼠,经融合筛选后获得能稳定分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株两株,分别命名为2C5和10A1。2C5和10A1杂交瘤细胞注射小鼠后腹水的效价分别为1:1.024×106和1:5.12×105。纯化后的两株单抗效价分别为1:5.12×105和1:2.56×105。Westernblot和ELISA检测结果表明两株单抗均能与鸡、鸭、鸽、鹅、鸵鸟等禽类血清反应,而不与猪、兔、牛等哺乳动物血清反应。结果显示所制备的抗IgY Fc CH3CH4片段单抗不仅可用于鸭IgY的检测,还可应用于其它多种禽类血清中IgY的检测。3.鸭疫里氏杆菌感染的抗体胶体金免疫层析检测试纸条的制备以鸭疫里氏杆菌基因组为模板,采用PCR扩增获得目的基因ive-2,大小为1062 bp。构建原核表达质粒pGEX-KG-IVE-2,诱导表达融合蛋白GST-IVE-2,大小约为66KDa。采用柠檬酸三钠还原法,制备了 20 nm胶体金,并用胶体金标记抗鸭IgY Fc CH3CH4片段单抗作为示踪物,IVE-2蛋白作为检测线,羊抗鼠IgG多克隆抗体作为质控线,制备鸭疫里氏杆菌胶体金免疫层析快速检测试纸条。对该试纸条最佳组装条件进行了摸索,结果表明胶体金标记两种单克隆抗体2C5和10A1的最佳标记量分别为4 μg McAb/mL Gold和6 μgMcAb/mL Gold,最佳标记pH为每毫升胶体金加入10μL0.1mol/L K2CO3溶液;经试验选择10A1株为最佳金标单抗,喷金量为15μL/cm;最佳抗原包被浓度为1.5mg/mL;包被液选择0.01mol/L PB缓冲液;样品稀释液选择0.01 mol/LPBS(pH7.4)。试纸条特异性检测结果显示自然感染鸭疫里氏杆菌鸭血清反应为阳性,而鸭疫里氏杆菌灭活疫苗免疫的鸭血清或其他病原感染鸭或鸡血清均检测为阴性;鸭感染后第5 d可通过ELISA方法检测到感染血清中抗IVE-2的抗体,感染第7 d可通过胶体金方法检测到。结果显示所组装试纸条具有良好的特异性和准确性。所制备的鸭疫里氏杆菌胶体金试纸条可用于鸭疫里氏杆菌感染的快速诊断,并可区分灭活疫苗免疫鸭和自然感染鸭。