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研究背景β细胞功能障碍主要指在糖脂毒性的病理因素下,β细胞分泌胰岛素功能受损或β细胞数量减少,其是2型糖尿病发病的核心。而β细胞凋亡是其数量减少和功能障碍的最终形式。前期文献综述发现,自噬与β细胞凋亡存在非常复杂的交互关系。一方面,适度自噬能使靶细胞在遭受应激时,通过去除受损细胞器,维持细胞稳态,保护细胞免于凋亡;另一方面,自噬过度激活又能促进细胞发生凋亡,引起细胞损伤。因此,细胞自噬和凋亡与β细胞功能障碍密切相关,但是目前针对胰岛β细胞自噬与凋亡的研究与防治手段仍非常有限。参芪地黄汤出自清·沈金鳌《沈氏尊生书》卷三《杂病源流犀烛·大肠病源流》,倪青教授在原方基础上将人参改为党参,熟地改为生地黄,加用地骨皮、泽泻、葫芦巴。全方攻补兼施,扶正祛邪,具有气阴双补,滋肾健脾的功效。且网络药理学结果显示,该方可能对PI3K、AKT等蛋白具有调控作用。因此,本研究拟结合体内、外实验,探讨参芪地黄汤加减方对β细胞功能障碍的改善作用,并进一步深入探讨该方基于PI3K/AKT/mTOR信号通路调控β细胞自噬与凋亡的分子机制。研究目的结合体内外实验,观察参芪地黄汤加减方改善高脂联合小剂量STZ诱导的T2DM大鼠,以及高糖联合棕榈酸钠诱导的RINm5F细胞损伤的作用,并进一步从细胞自噬与凋亡角度,基于PI3K/AKT/mTOR信号通路,探讨参芪地黄汤加减方改善胰岛β细胞功能障碍的作用机制。研究方法1体内实验:75只SPF级雄性SD大鼠,随机选取10只普通饲料喂养,其余65只大鼠通过高脂饮食5周加腹腔注射STZ（35mg/kg）建立T2DM大鼠模型。将造模成功的T2DM大鼠随机分为正常组、模型组、参芪地黄汤加减方高、中、低剂量组、二甲双胍组,各组分别以相应药物灌胃8周。记录各组大鼠一般状态及给药前后每周体重的变化、进食量与饮水量的变化;检测大鼠给药前（0周）与给药4周、8周末时的空腹血糖（Fastingbloodglucose,FBG）;并于8周末行葡萄糖耐量试验（OGTT）,评估各组大鼠的糖代谢情况。各组大鼠干预8周后处死,腹主动脉取血,用于后续糖化白蛋白（GA）、空腹胰岛素（FINS）、血脂（CHO、TG、LDL-C、VLDL、HDL-C）的检测,并计算HOMA-β、ISI,评估各组大鼠的胰岛功能及脂代谢情况;行肝脏和胰腺指数测量,并对胰腺组织进行HE染色。综合以上检测结果评估参芪地黄汤加减方在改善T2DM大鼠糖脂代谢、改善胰腺组织形态、减轻胰腺组织损伤,从而改善胰岛细胞功能障碍,维持糖稳态的作用。为进一步明确参芪地黄汤加减方改善β细胞功能障碍的作用机制,采用透射电镜观察胰腺组织（胰尾部）自噬小体数量;蛋白免疫印迹法检测PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR表达水平,及其下游的自噬效应分子LC3-Ⅱ、Beclin-1的表达水平;并且用RT-PCR法检测Caspase-3、Bax、Fas mRNA表达水平。2体外实验:通过25mM高糖联合250μM棕榈酸钠诱导24h建立RINm5F细胞损伤模型。分别采用动物实验部分确定的参芪地黄汤加减方高剂量及动物饮用水灌胃SD大鼠,制备参芪地黄汤加减方含药血清和空白血清,备用。采用CCK-8法评估参芪地黄汤加减方含药血清对细胞的毒性作用,以及确定参芪地黄汤加减方含药血清干预的高、中、低浓度范围。然后将RINm5F细胞分为空白对照组、模型组、参芪地黄汤加减方含药血清高、中、低剂量组,通过倒置相差显微镜观察各组RINm5F细胞的形态变化;采用放射免疫法检测各组细胞的胰岛素分泌水平,采用流式细胞术及Hoechst 33342试剂盒检测各组细胞的凋亡情况,明确参芪地黄汤加减方减少细胞凋亡、改善胰岛β细胞功能障碍的作用。为进一步明确其是否是基于PI3K/AKT/mTOR通路调控自噬发挥胰岛细胞保护作用,分别采用自噬诱导剂雷帕霉素及自噬抑制剂3MA验证其作用机制,采用透射电镜观察各组自噬小体情况;蛋白免疫印迹法检测PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR表达水平,及其下游的自噬效应分子LC3-Ⅱ、Beclin-1的表达水平;并采用RT-PCR法检测Caspase-3、Bax、Fas、Bcl-2 mRNA表达水平,从细胞层面对体内实验结果进行验证。研究结果1体内实验部分:（1）参芪地黄汤加减方能明显改善T2DM大鼠多食症状（P＜0.05）,对体重及多饮症状改善不明显（P＞0.05）;（2）参芪地黄汤加减方可以明显降低T2DM大鼠FBG、GA（P＜0.05）,改善葡萄糖耐量（P＜0.05）,促进空腹胰岛素分泌（P＜0.05）,提高HOMA-β和ISI（P＜0.05）;（3）参芪地黄汤加减方能够降低T2DM大鼠肝脏指数（P＜0.05）,降低 TG、LDL-C、VLDL 水平（P＜0.05）,升高 HDL-C（P＜0.05）,改善脂代谢;（4）HE染色结果显示参芪地黄汤加减方具有改善T2DM大鼠胰腺组织形态、减少胰岛细胞空泡变性、减轻胰腺组织损伤的作用。以上药效学实验结果以参芪地黄汤加减方高剂量组效果最佳。（5）透射电镜结果显示,模型组胰腺组织自噬小体数量增多,还可观察到线粒体自噬及线粒体呈“绒线球”状的改变。与模型组相比,参芪地黄汤加减方组线粒体自噬及自噬小体数量减少,偶可见典型的双层膜样结构,且线粒体形态紊乱较模型组有所改善;（6）Western Blot检测结果显示,参芪地黄汤加减方低、中、高剂量组均能明显上调p-AKT、p-mTOR蛋白表达、下调LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表达水平（P＜0.05）;（7）RT-PCR检测结果显示,参芪地黄汤加减方中、高剂量组可以明显下调Caspase-3、BaxmRNA表达（P＜0.05）,参芪地黄汤加减方低、中、高剂量组均可明显下调Fas mRNA表达水平。2体外实验部分:（1）以25mM高糖联合250μM棕榈酸钠诱导胰岛RINm5F细胞损伤的方法,可以成功建立稳定的体外胰岛细胞损伤模型;（2）20%范围内的参芪地黄汤加减方含药血清对细胞毒性均较小,参芪地黄汤加减方含药血清干预RINm5F细胞损伤模型的适宜浓度范围为5%-15%的含药血清;（3）参芪地黄汤加减方含药血清可明显提高RINm5F细胞活力（P＜0.05）,改善细胞形态,促进胰岛素分泌水平（P＜0.05）;（4）Hoechst 33342染色结果显示参芪地黄汤加减方各组均可改善细胞核形态,减少致密浓染细胞核和细胞碎片数量;流式细胞术结果显示参芪地黄汤加减方各组含药血清均能够明显降低RINm5F细胞损伤模型的凋亡率（P＜0.05）,其中以15%含药血清组效果最为显著。故采用15%参芪地黄汤加减方含药血清进行后续分子机制研究。（5）透射电镜结果显示,模型组镜下可观察到大量自噬小体,在细胞核附近也可见典型的自噬小体,即由双层膜或单层膜包裹部分胞质形成的封闭、圆球形结构;15%参芪地黄汤组偶可见自噬小体,较模型组自噬小体数量减少,加入雷帕霉素后,自噬体数量增加;（6）Western Blot检测结果显示,15%参芪地黄汤加减方含药血清可以明显上调p-AKT、p-mTOR蛋白表达（P＜0.05）、下调LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表达水平（P＜0.05）,加入雷帕霉素后,其磷酸化AKT、mTOR蛋白的作用被抵消（P＜0.01）;（7）RT-PCR检测结果显示,15%参芪地黄汤加减方组可以明显下调Caspase-3、Bax、Fas mRNA表达（P＜0.05）,并上调Bcl-2 mRNA表达水平（P＜0.05）,加入雷帕霉素后,其作用被减弱或抵消。研究结论1参芪地黄汤加减方具有显著调节T2DM大鼠糖脂代谢、改善胰腺组织形态结构、促进胰岛素分泌,改善胰岛β细胞功能障碍的作用。2参芪地黄汤加减方可显著提高RINm5F细胞活力,具有改善细胞形态、促进胰岛素分泌、抑制RINm5F细胞凋亡的作用。3参芪地黄汤加减方改善胰岛β细胞功能障碍的作用可能是通过激活PI3K/AKT/mTOR信号转导通路,下调下游自噬效应分子LC3-Ⅱ、Beclin1蛋白的表达,抑制胰岛β细胞过度自噬,并下调Caspase-3、Bax、Fas mRNA表达,抑制细胞凋亡实现的。