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伞滑刃属线虫(Bursaphelenchus Fuchs,1937)是一类由昆虫携播的食菌或植物寄生线虫,目前已报道近100种,其中松材线虫(B.xylophilus)和椰子红环腐线虫(B.cocophilus)是国际重要检疫对象。松材线虫主要通过木质包装或木材的远距离运输传播,在我国口岸对进境木质包装检疫时,伞滑刃属线虫种类较多,十分常见。各种伞滑刃线虫——尤其松材线虫及其近似种形态特征十分相似,鉴定难度很大。本研究对近年来宁波口岸从进境木质包装中截获的多种伞滑刃属线虫。主要是部分新种进行了研究,开展了M型松材线虫的形态和分子鉴定特征研究,并对该属线虫的ITSPCR-RFLP图谱、分子系统发育分析及分组等进行了较系统的研究。主要研究结果如下:
1.对宁波口岸进境木质包装中的截获的8个伞滑刃属线虫新种进行了较详细的记述,分别是非洲伞滑刃线虫(B.africanus sp.n.)(包括2个亚种)、伯氏伞滑刃线虫(B.burgermeisteri sp.n.)、欧斐切伞滑刃线虫(B.obeche sp.n.)、大尖尾伞滑刃线虫(B.macromucronatus sp.n.)、布拉希伞滑刃线虫(B.braaschae sp.n.)、拟小刺伞滑刃线虫(B.paraparvispicularis sp.n.)以及2个未发表种。此外,还对俄罗斯木质包装中新记录种杨伞滑刃线虫(B.populi)进行了描述。
2.开展了M型松材线虫(mucronate form of B.xylophilus)形态和分子鉴定特征研究。将来自美国、加拿大以及从进境木质包装中截获的5个M型松材线虫株系和多个R型松材线虫(round-tailedform of B.xylophilus)及东亚型和欧洲型拟松材线虫株系进行形态学和分子鉴定特征比较。发现这些种类的交合刺形态相似,M型松材线虫与R型松材线虫的区别是前者均有明显的尾尖突,平均长约2.2-3.0μm,而后者尽管有些个体有不到2μm的尾尖突(有时更长),但群体内总有些无尾尖突的个体。M型松材线虫与欧洲型拟松材线虫的区别是尾尖突长度(平均长约2.2-3.0μm vs4-5μm)及排泄孔位置(多在中食道球后,有时在中食道球附近,但从不在中食道球前vs多数在中食道球附近或更前,偶尔在中食道球后);与东亚型拟松材线虫的区别主要是雌虫尾形(尾亚圆柱形尾,尾尖突与尾端缢缩vs尾亚圆锥形,尾尖突与尾几乎连续,缢缩不明显)。通用的5种限制性内切酶(RsaⅠ,HaeⅢ,MspⅠ,HinfⅠ和AluⅠ)获得的M型和R型松材线虫的ITS PCR-RFLP图谱完全一致,但用Hpy188Ⅰ和HhaⅠ可以将两者区分开来。基于ITS、28S和COI基因序列的系统发育分析能把R型和M型松材线虫区分开来,但其遗传距离很接近。
3.以宁波口岸截获和培养保存的伞滑刃属线虫为基础,综合Wolfgang等的研究成果,共整理获得48种伞滑刃属线虫(包括A,B两个未发表种,B.africanus、B.leoni、B.mucronatus和B.sexdentati各有2种生物型或地理型)的ITS-RFLP图谱,并对相应的序列进行分析,给出了准确的酶切片段长度。尽管由于存在ITS区序列的微不均一性或异质性(Microheterogeneity)现象,偶尔会造成同种线虫ITS-RFLP图谱的细微差异,但由于这一现象较罕见(至今仅发现5种伞滑刃线虫有该现象),并且都只是其中一种酶切结果略有差异,因此这对依据ITS-RFLP图谱进行种类鉴定影响甚微。研究表明ITS-RFLP图谱分析不但可以进行准确的种类鉴定,还能对种内的亚种或地理型进行进一步区分。
4.通过对截获和保存的伞滑刃属线虫的测序以及从GenBank序列下载,进行了51种(亚种)的18S、53种(亚种)的ITS和57种(亚种)的28S基因序列的系统发育研究。发现B.abruptus位于其他伞滑刃属群体之外,4条侧线线虫聚类关系比较清晰,可明显分为xylophilus组、fungivorus组、africanus组、cocophilus组、kevini组、tokyoensis组和okinawaensis组,但4条侧线的sexdentati组则与2条和3条侧线的种类聚在一起,形成一个复杂的大分枝,而sexdentati组和其他多种2条和3条侧线的种类都是由小蠹传播的。2条侧线与3条侧线的群体亲缘关系较近,分组关系不清晰,可能是由4条侧线的类群进化而来。本研究以系统发育关系为基础,依据伞滑刃属线虫侧线数、雄虫尾乳突数量与排列方式及交合刺形状。以及雌虫有无阴门盖、后阴子宫囊长度、雌虫尾部形态及测计值(a,c,c’)等,将已确认的95个有效种中的76种分为14组(另19种由于早年的原始文献中侧线、乳突重要的形态特征没有清晰的描述,以后也没有发现记录,并且其特征也与其他线虫差异较大,不能确定其分组地位),并制订了分组检索表,建立了能反映其自然演化关系的分组鉴定体系。