论文部分内容阅读
CRISPR系统的发现给生物技术和分子生物学领域带来了重大变革,包括在多种活细胞和生物体内的基因组编辑和基因表达的调控。虽然这项技术为生物学、医学、农业带来了潜在的好处,但随之而来的由于基因组编辑后产生的不可逆的副产物,包括基因组范围内广泛的突变以及激活P53导致细胞死亡等问题依然严峻。与Cas9核酸酶相比,碱基编辑器在没有造成DNA双链断裂的前提下,能够精确替换基因组中靶向位点的碱基。胞嘧啶碱基编辑器(CBEs)能够将C·G碱基对替换为T·A碱基对,腺嘌呤碱基编辑器(ABEs)能够将靶向位点的A·T碱基对替换为G·C碱基对。然而,最近大量的研究证据显示在基因编辑过程中一些不想要的副产物广泛存在,如在细胞、动物、植物和其它生物体基因组中出现的小片段的插入和缺失(indels)。此外,在使用CBE和ABE基因编辑系统编辑的细胞中,科学家证实存在大量的脱靶效应。因此,严重的脱靶效应极大的限制了将碱基编辑器应用于未来精准的基因治疗。最近研究发现,存在于细菌和噬菌体相互进化过程中产生的噬菌体编码的Anti-CRISPR蛋白质,能够使自然界中某些CRISPR系统失活。由于CRISPR-Cas系统的多样性,CRISPR系统的拮抗剂也广泛的分布在噬菌体中。此外,科学家已经设计将Anti-CRISPR蛋白应用于真核生物的基因编辑方面,包括用于CRISPR-Cas系统的光控调节、基因表达的调控以及CRISPR-Cas系统复合物含量的检测。在本研究中,由于BE3和ABE7.10系统都是基于CRISPR-Cas系统开发的定向碱基编辑器系统,因此,我们通过将碱基编辑器质粒与Anti-CRISPR表达质粒共转染到HEK293T细胞中,通过基因组测序的方法筛选并鉴定碱基编辑器的抑制剂,实验结果表明在诸多抑制剂中AcrIIA2、Acr IIA4和Acr IIA5能够在哺乳动物细胞中有效抑制碱基编辑器BE3和ABE7.10系统,特别是一种新发现的抑制剂Acr IIA5具有较大的抑制作用。随后,我们通过将1:1、1:3、1:5等不同浓度梯度的抑制剂质粒与碱基编辑器系统共转染细胞,实验结果表明Acr IIA5在不同浓度下均能高效抑制碱基编辑器系统。此外通过将碱基编辑器变体质粒与Anti-CRISPR表达质粒共转染到HEK293T细胞中,结果显示Acr IIA5能够抑制NGG PAM靶向的效率最强的C变T碱基编辑器Anc BE4max和A变G碱基编辑器ABEmax,还有NG PAM靶向的多种碱基编辑器NG-Anc BE4amx、NG-ABEamx、xCas9-AncBE4max和xCas9-ABEmax等变异体系统。我们进一步证明,在转染碱基编辑器质粒3或者6小时后,添加AcrIIA5可以显著降低碱基编辑器BE3和ABE7.10产生的脱靶效应。本研究表明,AcrIIA5能够作为一种广泛使用的精确控制碱基编辑器编辑的工具,而且为将来的基因治疗提供了新的技术基础。