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皮考啉酸(又名2-吡啶甲酸)是吡啶甲酸的2-位取代同分异构体,也是重要的有机合成中间体,在生产和生活中具有普遍应用。吡啶类农药由于其更高的生物活性、更高的选择性等特点而得到迅速的发展,因此作为吡啶衍生物的皮考啉酸在农药领域的应用将越来越广。同时,皮考啉酸是生物体内色氨酸代谢及硝基苯和2-氨基苯酚的微生物降解副产物;环境中煤油和骨油中的2-甲基吡啶的氧化,除草剂毒莠定、敌草快等的光降解过程也都是皮考啉酸的来源。由于皮考啉酸具有生物毒性,其应用和来源的广泛性使其在环境中逐渐积累,对生态系统和人体健康产生威胁。微生物降解环境中的皮考啉酸具有高效、安全的优点。目前关于皮考啉酸的降解研究较少,且局限于菌株水平,尚未有基因或分子水平的报道,因此有必要深入研究皮考啉酸的转化和微生物降解机制。本文旨在分离高效的皮考啉酸降解菌,并阐述其对皮考啉酸的降解特性及降解机理,以为皮考啉酸广泛应用后的污染治理提供生物资源及理论和技术依据,同时也将对吡啶及其衍生物的微生物降解研究具有参考意义。主要研究结果如下:(1)通过不断的富集、分离和纯化从杭州城市污水中筛选到一株皮考啉酸降解菌,命名为JQ135,通过菌落形态观察、Vitek系统鉴定及16SrRNA基因(GenBank登录号为KT988067)系统发育分析,将其鉴定为粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)。菌株保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCCM 2015812。(2)利用紫外扫描、高效液相色谱检测JQ135降解皮考啉酸过程中底物的残留量对JQ135的降解特性进行了初步探究。JQ135的降解行为受皮考啉酸诱导。经过皮考啉酸预培养的JQ135在接菌量10%时,能够以50-300 mg/L皮考啉酸为唯一碳源生长,并可在30h内完全降解掉50-300 mg/L的皮考啉酸。降解最佳pH为7.0,最适温度为30℃,100%接菌量进行降解时,降解速率最快。通过对菌株降解皮考啉酸的降解液定时取样并检测紫外吸收变化,利用高效液相色谱-质谱联用鉴定出了中间代谢产物6-羟基皮考啉酸(6-hydroxypicolinicacid,6HPA),结合已有研究,初步推测出JQ135降解皮考啉酸的途径,即皮考啉酸→6HPA→3,6-二羟基皮考啉酸(3,6-dihydroxypicolinic acid,3,6-DPA)2,5-二羟基吡啶(2,5-dihydroxypyridine,2,5-DHP)→→→CO2+H2O+NH3。(3)利用pSC123转座子诱变及影印平板的方法构建了 JQ135的转座子突变株文库,筛选到皮考啉酸降解失活株共12株,根据生长和降解能力分为a,b,c三种类型。a型有8株,既不能利用皮考啉酸为唯一碳源生长,也不能降解皮考啉酸。b型有1株,命名为Mut-G31,虽不能利用皮考啉酸为唯一碳源生长,但能够降解皮考啉酸至等摩尔数的6HPA而无法继续降解,这进一步验证了 6HPA是皮考啉酸的降解中间产物,同时此突变株可用于工业上重要有机合成中间体6HPA的制备。c型有3株,不能利用皮考啉酸为唯一碳源生长,但能完全降解皮考啉酸。(4)Mut-G31与JQ135在LB中的生长特性无明显差异。通过SEFA-PCR方法获得了大小为4103bp的DNA片段(Genbank登录号为KY195989)。序列分析发现该DNA片段存在三个完整的ORF,命名为orf1,orf2,orf3,其中orf1基因功能未知,orf2基因编码的蛋白与流感嗜血杆菌Haemophilus infunzae中的3-脱氧-D-甘露-辛酮糖酸激酶(Kdka)有32%的相似度,orf3基因编码的蛋白与铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa PA14中的腐胺结合周质蛋白有48%的相似度。转座子插入位点在orf2起始密码子之后的527到528 bp之间。(5)将完整orf2基因orf2-gtg和部分orf2基因orf2-atg酶连到广宿主载体pBBR1-MCS5并分别回补到Mut-G31中检测回补菌株对皮考啉酸的利用情况,回补菌株Mut-G31 gtg恢复了利用和完全降解皮考啉酸的能力,证明orf2基因以GTG起始,且对6HPA的降解和利用具有一定的作用,但其并非降解6HPA的功能基因。本研究首次从基因水平上研究了皮考啉酸的微生物降解。