论文部分内容阅读
目的:脊髓损伤多由于物理创伤引起，是一种会导致脊髓损伤支配平面以下的肢体功能丧失的一种的损伤。脊髓损伤可能发生于脊髓的各个节段，可分为完全损伤和不完全损伤，表现为不同程度的感觉功能、运动功能以及各种生理反射的异常或者丧失。干细胞的移植，能够在一定程度地改善损伤脊髓的功能，但是受限于被移植细胞的分化率，治疗效果并不理想，更达不到临床应用的水准。骨髓间充质干细胞易于分离获得、增殖迅速、免疫原性低并具有跨胚层分化的潜能。骨髓间充质干细胞一种是多能干细胞，具有体外增值能力，还有分化为骨、肌肉、神经等多种胚层来源细胞的潜在能力。某些抗氧化剂能够促进骨髓间充质干细胞向神经元细胞分化。正常产生的活性氧会在自由基清除酶和抗氧化剂的参与下被清除。在很多条件下，活性氧还参与了调节多种诸如细胞增殖、细胞分化等细胞的生理过程。大量的活性氧不能被体内的抗氧化酶系统和细胞内的小分子抗氧化剂及时清除，就会造成细胞的氧化应激反应，导致细胞的凋亡、坏死。有效地控制活性氧水平能够抑制细胞的凋亡，促进干细胞分化，继而提高骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤的疗效。 研究方法:本研究中我们将实验分为两部分。第一部分中，在体外培养了大鼠骨髓间充质干细胞，用β-巯基乙醇诱导骨髓间充质干细胞向神经元细胞分化，采用镜下观察以及神经元特异性标记物检测来确定细胞的分化。以空白对照组和H2O2处理组与β-巯基乙醇诱导组进行细胞内活性氧水平的测定，以及相关通路的表达测定，寻找Notch1信号通路与活性氧浓度之间的关系。在第二部的实验中，们用H2O2诱导骨髓间充质干细胞发生凋亡，并用H2O2/β-巯基乙醇共同处理细胞，来发现β-巯基乙醇对凋亡的抑制作用。通过光镜，荧光显微镜以及流式细胞仪检测的方法，对比各组之间凋亡的差异。对比各组之间的细胞内活性氧水平，以及凋亡相关通路，来探究β-巯基乙醇抗凋亡的机制。 结果:β-巯基乙醇诱导骨髓间充质干细胞向神经元细胞分化，倒置相差镜下观察，BMSCs的细胞质逐渐向细胞核收缩，细胞体逐渐向多极形状变化，并轴向向远端延伸。倒置荧光显微镜下，诱导5小时后的BMSCs细胞质呈现出NSE的高表达。Western blot分析:NSE的表达随着处理时间的加长升高。Nestin的表达随着处理时间的加长升高。Notch1的表达随着处理时间的加长降低。检测β-巯基乙醇对细胞内的ROS水平的作用，DCFH-DA测定:β-巯基乙醇能够降低细胞内的ROS水平，H2O2能够提高细胞内的ROS水平。Western blot分析:Notch1和Hes1的表达与ROS的水平正相关。H2O2诱导BMSCs凋亡，β-巯基乙醇抑制凋亡。倒置相差显微镜下观察:H2O2处理组中的细胞视野当中可见大量体积缩小、亮度增加的凋亡细胞。 H2O2/β-巯基乙醇共同处理的体积缩小、亮度增加的凋亡细胞数量较H2O2处理组明显下降。Hoechst33258染色:H2O2处理组中的细胞视野当中可见大量细胞核致密浓染或呈碎块浓染的凋亡状态。而H2O2/β-巯基乙醇共同处理的凋亡细胞数量较H2O2处理组明显下降了。流式双染细胞术检测细胞凋亡情况:H2O2处理组与空白对照组相比，细胞凋亡率明显上升了。H2O2/β-巯基乙醇共同处理组与H2O2处理组相比，细胞凋亡率明显下降了。DCFH-DA测定:H2O2能够提高细胞内的ROS水平。H2O2/β-巯基乙醇共同处理组ROS比H2O2处理组降低了。Western blot检测相关蛋白的表达，与空白对照组相比，H2O2处理组的Bax和caspase3的表达上升了，而抑制凋亡的Bcl-2的表达下降了。H2O2/β-巯基乙醇共同处理组与H2O2处理组相比，Bax和caspase3的表达下降了，而抑制凋亡的Bcl-2的表达上升了。Akt表达没有明显差异。与空白对照组相比，H2O2处理组的p-Akt的表达下降了。H2O2/β-巯基乙醇共同处理组与H2O2处理组相比p-Akt的表达上升了。 结论:β-巯基乙醇作为一种抗氧化剂，在适当的浓度下能够在体外促进骨髓间充质干细胞向神经元细胞分化，这一过程与细胞内活性氧的下降，Notch1信号通路抑制，Hes1基因表达下降有关。β-巯基乙醇能够直接降低细胞的活性氧水平，从而，通过调节Akt的磷酸化水平，继而调节凋亡相关的caspase家族、Bcl-2家族蛋白的表达水平，来抑制H2O2诱导产生的凋亡。