论文部分内容阅读
1.研究背景脑恶性胶质细胞瘤约占原发性中枢神经系统肿瘤的40%-53%,传统多采用手术治疗,由于其呈浸润性生长,大多与正常脑组织无明显分界,手术难以做到彻底切除,以手术治疗为主,辅以放疗、化疗等综合治疗方案,生存率仍较低。目前临床上大多数抗肿瘤药物存在对机体损害大、毒副作用强的不良反应,最终造成患者因无法承受药物不良反应带来的巨大痛苦而停药,而且在化疗过程中肿瘤细胞易产生对细胞毒药物的耐药性,从而使肿瘤治疗的效果得不到显著提高。目前,寻求安全、低毒、有效、能逆转肿瘤细胞耐药的抗肿瘤药物一直倍受关注。因此,从天然化合物中寻找此类抗肿瘤药物已经成为肿瘤治疗的重要发展战略之一。20(S)-原人参二醇(aPPD)是人参皂苷经过胃肠道菌群的去糖代谢活化后产生的具有药物疗效的活性成分,具有广谱的抗肿瘤作用。近年来,英属哥伦比亚大学的William Jia课题组对aPPD体内外抗肿瘤活性进行了系列研究,发现其具有双重药理作用,一方面可直接杀伤肿瘤细胞,促其凋亡；另一方面可保护神经元免受细胞毒物质的侵害。近年来有关肿瘤形成机制的研究发现,多数肿瘤细胞中致癌基因Akt的活性升高,并且证实Akt活性的平衡对细胞生长与凋亡具有重要的调节作用,如何抑制Akt活性已成为抑制肿瘤生长研究的热点。脂筏(lipid rafts)是质膜中富含鞘磷脂、胆固醇和酰化蛋白质的动态微区,参与运输和细胞内信号转导,Akt信号通路上许多重要蛋白酶的活化均在此发生,是肿瘤发生的重要场所。因为aPPD的结构与胆固醇相似,故可通过改变脂筏上的脂质和蛋白质的构成及相互作用而调节Akt信号通路。因此,探讨aPPD抑制与脂筏相关的Akt信号转导通路及诱导肿瘤细胞凋亡的机制是一项很有前景和研究价值的课题,不但为中医药抗肿瘤机制的研究提供了新思路,而且为癌症的治疗提供了新靶点,具有重要的经济和社会价值。2.目的探讨aPPD抑制与脂筏相关的Akt信号转导通路及诱导肿瘤细胞凋亡的作用机制。3.方法在本课题中,我们比较了脑胶质瘤细胞U87MG和神经瘤细胞Neuro-2a经过aPPD处理后Akt信号转导通路的变化及对其功能的影响情况。(1)采用普通光镜观察aPPD诱导U87MG细胞发生凋亡的形态学改变；(2)MTT法测定ICs0值及确定aPPD诱导细胞凋亡的最佳有效浓度；(3)免疫荧光染色采用共聚焦显微镜并结合免疫共沉淀观察aPPD用药后对细胞脂筏的影响及PDK1与Akt共定位和结合力的情况；(4)蛋白免疫印迹法检测脂筏上的Akt信号转导通路中Akt及磷酸化Akt(Thr308和Ser473位点)情况,Akt上游P13K(p85和p110亚基)、PDK1、ILK1、mTORC2、PHLPP (PHLPP1和PHLPP2), Akt下游Bad及磷酸化的Bad (Ser136和Serl 12位点)等相关蛋白磷酸化情况。(5)采用MTT法结合蛋白免疫印迹法检测aPPD与化疗药物联合使用后可提高耐药细胞对化疗药物的敏感性情况；(6)选择体外划痕实验测定aPPD处理后的U87MG和N2a细胞24h的细胞迁移率。4.结果(1) aPPD可高效地干扰脂筏上蛋白质的构成及其相互作用但不改变胆固醇的含量；(2) aPPD对脂筏蛋白的影响因细胞类型不同而异；(3)aPPD抑制了脑胶质瘤细胞脂筏上Akt的活性,却提高了神经元细胞脂筏上Akt的活性,但并不影响两种细胞总质膜上Akt的活性；(4) aPPD通过调节与脂筏相关的Akt上游的磷酸酯酶活性以影响Akt的活性,并因细胞类型不同而异；(5)因细胞类型不同,aPPD对脂筏介导的Akt信号转导通路的不同影响导致了不同的药理作用,即aPPD可提高U87MG细胞对TAXOL或Vinblastine等化疗药物的敏感性,却减缓了NMDA对N2a细胞的兴奋毒性作用。5.结论与脂筏相关的Akt的活性决定了细胞的功能,而不是总质膜所决定的；因细胞类型不同,脂筏调节Akt信号转导通路的作用也不同；aPPD有望成为抗肿瘤药物研发的热点。