论文部分内容阅读
1 BVDV-1和BVDV-2的检测与鉴别RT-PCR的方法建立根据已发表的牛病毒性腹泻病毒基因1型(BVDV-1)和2型(BVDV-2 )5′非编码区(5′-UTR)的基因序列,分别设计出针对BVDV-1、BVDV-2以及BVDV-1和BVDV-2的三对特异性引物,通过参考株BVDV-1 NADL和BVDV-2 890,建立了BVDV的RT-PCR检测方法。在此基础上,对疑似牛BVDV感染的临床病料组织器官(脾、肠系膜淋巴结、心肌、管骨骨髓等)进行检测,18份中检出BVDV-2阳性8份(44%)。2 BVDV-2的分离与鉴定进一步将上述检测为基因2型(BVDV-2)阳性的新疆、青海和山东病料分别接种MDBK细胞,分离和盲传8～13代后通过已建立的RT-PCR方法鉴定,各自都能分离到BVDV-2病毒,3株病毒分离毒株分别命名为XJ-04株、QH-92株和SD-06株。光学显微镜观察XJ-04株和SD-06株为致细胞病变型BVDV-2病毒,QH-92株为非致细胞病变型BVDV-2病毒;间接免疫荧光试验表明所分离的3株病毒分离株能与鼠源抗BVDV-2 890株糖蛋白E2(890株)重组蛋白血清发生免疫反应,产生特异性胞内荧光;制备超薄切片,电镜观察3株分离株病毒感染细胞的内质网中均存在约60nm大小的有囊膜的病毒粒子;病毒感染细胞经差速离心、20%蔗糖垫底超速离心后,提纯的病毒经磷钨酸负染,电镜观察到同样大小约60nm有囊膜的病毒颗粒。3 BVDV-2野毒株的糖蛋白E2基因、非结构NS2-3基因的克隆与序列分析用RT- PCR方法扩增BVDV-2分离株XJ-04、QH-92和SD-06的编码糖蛋白的E2基因及编码非结构蛋白的NS2-3基因,扩增出预期1116bp和1527bp大小的目的片段,与预期大小一致;并进一步将扩增出的目的片段克隆、序列测定。序列测定结果和同源性比较分析表明:XJ-04株、QH-92株和SD-06株的E2基因核苷酸与GenBank中BVDV-2参考株的E2基因核苷酸同源性在80.9%～92.1%之间,推导氨基酸同源性为83.1～93.5%; NS2-3基因核苷酸同源性与GenBank中BVDV-2参考株的NS2-3基因同源性在89.7%～91.8%,推导氨基酸同源性91.4%～93.5%。三个分离株的E2基因推导氨基酸同源性达99.5%,NS2-3基因推导氨基酸酸同源性均达到99.0%,通过系统发生分析发现XJ-04株、SD-06株、QH-92株与北美毒株p11Q、890、New York’93、1373、p24515亲缘关系较近。这是我国关于BVDV-2分离与鉴定的首次报道,本文建立的RT-PCR方法可用于BVDV-2的检测与鉴定。