局麻药(Local anesthetics, LA)神经毒性反应的报道逐渐增多,已引起临床高度重视,但目前LA引起神经毒性的确切机理尚未完全阐明。左旋布比卡因(Lvobupivacaine, LB)是一新型、长效酰胺类局麻药,理化性质和麻醉效能与布比卡因相似,心血管系统和中枢神经系统(Central nervous system, CNS)毒性比布比卡因低,具有广泛的应用前景,但其具体神经毒性机制尚不清楚。严重的LA神经毒性表现为细胞坏死,然而,越来越多的证据表明,凋亡已成为神经毒性发生的主要机制。人神经母细胞瘤是一种由新生儿的神经嵴衍生的肿瘤,其为发生于儿童中最常见的实体瘤。但与其他的人类肿瘤相比,神经母细胞瘤也是自发衰退率最高的肿瘤之一。SH-SY5Y细胞源于人神经母细胞瘤细胞系SK-N.SH的克隆,因其具有正常神经细胞的生物学及分子生物学特性,多作为研究神经细胞毒性的模型。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPKs)家族是由MAPK激酶激酶(mitogen activated protein kinase kinase kinase, MAPKKKs, MKKK)、MAPK激酶(mitogen activated protein kinase kinase, MAPKKs, MKK)及其下游激酶MAPKs共同组成。MAPKs家族能够对多种细胞生长因子和促进有丝分裂物质作出反应,把细胞外信号从细胞表面传导到细胞核内部,参与细胞基质、生长因子、炎症反应等重要信号途径,介导生长、发育、分裂分化、凋亡以及细胞间相互作用等多种细胞过程。氨基末端激酶(Jun N-terminal kinase,JNK)是MAPKs中三大激酶之一,大量研究显示,JNK的激活在神经元凋亡过程中发挥重要作用。凋亡刺激促使MAPKKKs的激活,进而激活MKK,激活的MKK通过磷酸化其下游JNK,促进靶基因表达,从而诱导凋亡。MKK的激活为JNK通路激活所必须,然而凋亡刺激如何促使MKK的介导并不完全清楚,已有研究报道JNK通路的激活参与布比卡因与罗哌卡因的神经毒性机制,布比卡因可刺激神经细胞内ROS(Reactive oxygen species,ROS)的爆发诱发凋亡,而ROS的产生可激活JNK通路,因此我们设想LB神经毒性机制与ROS与JNK通路有关。单磷酸腺苷激活蛋白激酶(Adenosine Monophosphate Activated Protein Kinase,AMPK)是一种丝／苏氨酸蛋白激酶,活化的AMPK可促进分解代谢,抑制合成代谢途径,以增加三磷酸腺苷(Adenosine Triphosphate,ATP)的产生。研究表明,在细胞中AMPK持续激活可引起ROS大量产生,从而导致细胞损伤和凋亡,然而AMPK激活ROS是否参与LB神经毒性机制,目前尚不清楚。我们在前期研究中已发现AMPK与LA,如布比卡因和罗哌卡因触发细胞内ROS产生、释放密切相关,然而ROS增多是否通过JNK通路诱发神经细胞凋亡仍未知。目前国内LB的临床研究多集中于药效学和药代动力学研究,关于其神经毒性机制研究甚少。藉此我们推测,LB激活了AMPK通路,导致ROS产量增加,进而激活MKKs,进一步激活下游JNK通路,导致SH-SY5Y细胞凋亡。综上所述,本研究以不同浓度LB处理SH-SY5Y细胞24h,检测细胞生存率,ROS平均荧光强度和凋亡比率,JNK蛋白及P-JNK蛋白；并应用了ROS抑制剂—N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl cysteine,NAC),通过转染小干扰RNA分子(small interfering RNAs,siRNA),MKK4与MKK7siRNA,进而确定ROS激活JNK的作用靶点。为证实LB如何增加ROS,将实验室内本研究组已经构建和鉴定的重组质粒pEGFP-N1-AMPKa2转染SH-SY5Y细胞,研究在AMPKa2高表达下,SH-SY5Y细胞受LB刺激后,与未转染组及空载质粒组相比,细胞内ROS、细胞活力及细胞凋亡率及下游JNK蛋白的变化,以验证上述推测。本研究旨在探索LB导致神经毒性的确切机制和原理,为临床麻醉防治LA神经毒性提供理论依据。第1章LB诱发ROS产生及SH-SY5Y细胞凋亡目的探讨LB诱发SH-SY5Y细胞产生的ROS水平与细胞凋亡的关系。方法SH-SY5Y细胞体外培养,细胞共分为12组,C组为对照组(未经药物处理),Lo.5-L2.5组(分别用0.5,1,1.5,2,2.5mM LB的培养液处理24h),N组(NAC预处理1h),N0.5-N2.5组(NAC预处理1h后,分别用0.5,1,1.5,2,2.5mM LB的培养液处理24h)。采用CCK-8(Cell Counting Kit)法检测细胞活力,流式细胞仪(flow cytometry,FCM)检测细胞内ROS平均荧光强度,Hochest33258检测凋亡荧光和FCM检测细胞凋亡率。统计学处理采用SPSS13.0统计学软件进行分析,计量资料以均数±标准差(x±s)表示。细胞活力,细胞ROS水平,细胞凋亡率采用两因素析因设计方差分析；单独效应分析时,组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA);多重比较采用LSD法,方差不齐时采用Welch法和Dunnett’s T3法。P<0.05为差异有统计学意义。结果(1)细胞活力经LB处理24h后细胞活力,细胞生存率呈现出剂量依赖性降低,L0.5-L2.5组之间差异有统计学意义(F=907.093,P=0.000),L2.5组细胞生存率最低,为(19.50±0.58)%；应用NAC预处理后,N-N2.5组细胞生存率均升高(F=14.346,P=0.000)。(2)Hoechst33258染色观察到经过不同浓度的LB处理后,SH-SY5Y细胞细胞核高度凝集显现出强蓝色荧光,尤以L2.0组强蓝色荧光的细胞数目最多,当SH-SY5Y细胞经NAC预处理后,强蓝色荧光细胞数目减少。(3)凋亡率LB处理各组细胞凋亡率有统计学差异(F=205.123,P=0.000),其中L2.0组的调亡率最高,为(24.07±1.12)%；ROS抑制剂NAC预处理后,凋亡率均降低(F=25.047,P=0.004)。(4)ROS平均荧光强度LB处理各组细胞ROS平均荧光强度有统计学差异(F=64.098,P=0.000),其中L2.0组ROS平均荧光强度最高为2113.33±188.81；NAC预处理后,各组ROS平均荧光强度均降低(F=100.423,P=0.023),其中N2.0组的荧光强度最高,NAC预处理后降低幅度最小(F=35.960,P=0.004)。结论LB可致SH-SY5Y细胞呈剂量依赖性细胞生存率降低与ROS依赖性细胞凋亡,ROS抑制剂NAC可减轻LB致细胞坏死及凋亡,LB为2mM时SH-SY5Y细胞凋亡率最高。第2章LB通过ROS/MKK7/JNK通路诱发SH-SY5Y细胞凋亡第一部分MKK4siRNA和MKK7siRNA对LB致细胞ROS及凋亡的影响目的检测SH-SY5Y细胞凋亡过程中MKK4与MKK7及ROS之间的联系。方法通过Q-PCR(Quantitative Polymerase chain reaction)筛选出转染效率最高的MKK4siRNA和MKK7siRNA,并且检测0,0.5,1,1.5,2,2.5mMLB作用24h后,MKK4mRNA与MKK7mRNA的表达。将筛选出的MKK4siRNA转染入细胞,LB浓度选择细胞调亡率最高的2mM浓度(第一章实验已证实)。细胞分组为：control组为对照组(未经转染及药物处理)；NAC组(单纯5mMNAC处理1h); MKK4siRNA组(单纯转染MKK4siRNA);LB组(单纯2mMLB处理24h)LB+NAC组(5mM NAC预处理1h后2mM LB处理24h)；LB+MKK4siRNA组(MKK4siRNA转染后,2mM LB处理24h)；LB+NAC+MKK4siRNA组(MKK4siRNA转染后,5mM NAC预处理1h后2mMLB处理24h)。MKK7siRNA转染分组同MKK4siRNA。FCM检测各组细胞凋亡率和细胞内ROS平均荧光强度。统计学处理采用SPSS13.0统计学软件进行分析,计量资料以均数±标准差(x±s)表示。MKK4mRNA和MKK7mRNA水平,细胞ROS水平,细胞凋亡率采用单因素方差分析(one-way ANOVA);多重比较采用LSD法,方差不齐时采用Welch法和Dunnett’s T3法。P<0.05为差异有统计学意义。结果(1)MKK4siRNA与MKK7siRNA的筛选分别筛选出沉默效果确切的MKK4siRNA和MKK7siRNA,其中siRNA-MKK4-3组的MKK4mRNA表达量为0.06±0.10,siRNA-MKK7-1组的MKK7mRNA的表达量为0.63±0.01。后续实验选择siRNA-MKK4-3和siRNA-MKK7-1。(2)MKK4mRNA与MKK7mRNA的表达经不同浓度LB处理后MKK4mRNA的表达量各组之间无统计学差异(F=0.661,P=0.660),MKK7mRNA表达量各组之间有统计学差异(F=1799.050, P=0.000), LB=2mM时,MKK7mRNA表达量最高205.63±5.19。(3)细胞凋亡率与对照组调亡率相比,MKK4siRNA组无统计学差异(P=0.601),LB组与LB+MKK4siRNA组相比,无统计学差异(P=1.000)；与对照组凋亡率相比,MKK7siRNA组凋亡率降低(P=0.005),与LB组相比,LB+MKK7siRNA组凋亡率降低(P=0.003)。(4)ROS荧光强度与对照组ROS平均荧光强度相比,MKK4siRNA组无统计学差异(P=0.095),LB组与LB+MKK4siRNA组相比,无统计学差异(P=0.171)；与对照组ROS平均荧光强度相比,MKK7siRNA组无统计学差异(P=1.000),LB组与LB+MKK7siRNA组相比亦无统计学差异(P=1.000),LB+NAC组低于LB组(P=0.015),LB+NAC+MKK7siRNA组低于LB组(P=0.024)。结论LB可激活ROS/MKK7通路进而导致SH-SY5Y细胞的凋亡第二部分MKK4siRNA和MKK7siRNA对LB致JJNK及P-JNK蛋白表达的影响目的检测SH-SY5Y细胞凋亡过程中ROS与MKK及JNK之间的联系。方法Western blot检测不同浓度LB作用于细胞后JNK及P-JNK蛋白表达。MKK4siRNA转染后细胞分组为：control组为对照组(未经转染及药物处理)；NAC组(单纯5mM NAC处理lh)；MKK4siRNA组(单纯转染MKK4siRNA);LB组(单纯2mM LB处理24h)；LB+NAC组(5mM NAC预处理1h后2mM LB处理24h); LB+MKK4siRNA组(MKK4siRNA转染后,2mMLB处理24h); LB+NAC+MKK4siRNA组(MKK4siRNA转染后,5mM NAC预处理1h后2mM LB处理24h)。Western blot检测各组细胞P-JNK蛋白表达。MKK7siRNA转染后分组同MKK4siRNA。统计学处理采用SPSS13.0统计学软件进行分析,计量资料以均数±标准差(x±s)表示。JNK及P-JNK蛋白表达水平采用单因素方差分析(one-way ANOVA);多重比较采用LSD法,方差不齐时采用Welch法和Dunnett’s T3法。P<0.05为差异有统计学意义。结果(1)LB处理后JNK, P-JNK表达细胞经过不同浓度的LB处理24h,各组JNK蛋白表达有统计学差异(F=685.027,P=0.000),与对照组对比,LB为0.5,1,1.5,2,2.5mM时的JNK蛋白表达降低(P值均为0.000),与LB为2mM相比,LB为0.5,1,1.5mM时JNK蛋白表达较高(P值均为0.000),LB为2.5mM时JNK蛋白表达较低；各组P-JNK蛋白表达有统计学差异(F=1449.76,P=0.000),对照组对比,LB为0.5,1,1.5,2,2.5mM时的P-JNK蛋白表达较高(P值均为0.000),与LB为2mM相比,LB=0.5,1,1.5mM时P-JNK蛋白表达较低(P值均为0.000),LB=2.5mM时P-JNK蛋白表达降低。综上所述,LB=2mM时JNK磷酸化程度最高。(2)MKK4siRNA转染后P-JNK表达MKK4siRNA转染后,多重比较示,对照组与MKK4siRNA相比无统计学差异(P=1.000),LB组与LB+MKK4siRNA组相比无统计学差异(P=0.548),LB+NAC组P-JNK蛋白表达水平低于LB组。(3)MKK7siRNA转染后P-JNK表达MKK7siRNA转染后,各组之间有统计学差异(F=2209.632,P=0.000),多重比较示,对照组与MKK7siRNA相比有统计学差异(P=0.000),对照组P-JNK表达水平高于MKK7siRNA组,LB+MKK7siRNA组低于LB组(P=0.000),LB+NAC+MKK7siRNA组低于LB+NAC组(P=0.000)和LB+MKK7siRNA组(P=0.000)。结论LB可通过ROS/MKK7/JNK通路进而引起SH-SY5Y细胞凋亡。第3章上调AMPKa2可促进LB通过ROS/MKK7JNK通路诱发SH-SY5Y细胞凋亡目的探讨过表达AMPKa2是否可介导LB通过ROS/MKK7/JNK通路诱发SH-SY5Y细胞凋亡。方法将质粒PEGFP-N1-AMPKa2和空载质粒pEGFP-N1分别转染SH-SY5Y细胞株,细胞分组为：control组(未转染任何质粒)；pEGFP-N1组(转染空载质粒pEGFP-N1); pEGFP-N1-AMPKα2组(转染质粒pEGFP-N1-AMPKα2); LB组(未转染任何质粒后2mMLB处理24h)：LB+pEGFP-N1-AMPKα2组(转染质粒pEGFP-N1-AMPKα2后2mMLB处理24h)；LB+pEGFP-N1组(转染质粒pEGFP-N1后2mMLB处理24h)。Western blot法检测鉴定AMPKα2表达水平,CCK-8法检测细胞活力,FCM检测细胞凋亡率与细胞内ROS含量,Western blot法检测鉴定P-JNK表达水平。统计学处理计量资料以均数±标准差(x±s)表示,采用SPSS13.0统计软件分析。AMPKα2, P-JNK蛋白吸光度值,CCK-8法检测细胞活力,ROS含量,细胞凋亡率采用两因素析因设计资料方差分析,组间比较采用LSD法(方差齐)或Dunnett’s T3法(方差不齐)。P<0.05有统计学差异。结果转染重组质粒pEGFP-N1-AMPKα2的SH-SY5Y细胞组,其AMPKα2表达上调；2mM LB处理后,与空载质粒pEGFP-N1细胞组及未转染质粒的细胞组相比,细胞内ROS含量提高,细胞活力降低,细胞凋亡率增多,P-JNK蛋白水平升高(P=0.000)；而空载质粒pEGFP-N1细胞组与未转染质粒的细胞组相比,其细胞活力,细胞内ROS含量和细胞凋亡率P-JNK蛋白水平,均无明显差异(P>0.05)。结论上调AMPKa2的表达可促进LB通过ROS/MKK7/JNK通路诱发细胞凋亡。