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目前,癌症已经成为影响人们健康的重大疾病,寻找有效的抗肿瘤药物成为治疗癌症的主要方向。抗菌肽(antimicrobial peptides)是多种生物天然免疫系统中的重要组成部分,它对正常真核细胞没有毒性,且抗菌谱广,除了具有我们所熟悉的抗细菌和真菌活性外,还具有抗病毒和抗癌等功能。更为重要的是,因为抗生素的滥用导致菌株产生了抗性,而抗菌肽特殊的抗菌机理,使其有希望开发成为一类新型的广谱高效抗菌和抗肿瘤药物。抗菌肽 Scolopin-2 是从少棘蜈松(Scol opendra subspinipesmutilans)中分离得到的线性的、具有α螺旋一端亲水一端疏水的阳离子肽,由25个氨基酸组成。它具有较广泛的抗菌、抗病毒和杀伤某些肿瘤细胞的能力。但与传统抗生素和抗肿瘤药物相比,抗菌肽Scolopin-2在较高浓度下才表现出抗菌活性和抗肿瘤作用。因此,本研究开始着手对抗菌肽进行分子改造和修饰,以期找到更理想的抗菌肽。本课题研究具体分为4个部分:1.为了提高抗菌肽的抗菌、抗肿瘤作用,我们对抗菌肽进行了以下3种分子改造:①将C末端的组氨酸酰胺化:Scolopin-2-NH2,序列为:GILKKFMLHRGTKVYKMRTLSKRSH-NH2;②N 端加 RGD:RGD-Scolopin-2,序列为:RGDGILKKFMLHRGTKVYKMRTLSKRSH;③N端加RGD序列并且将C末端的组氨酸酰胺化:RGD-Scolopin-2-NH2,序列为:RGDGILKKFMLHRGTKVYKMRTLSKRSH-NH2通过琼脂糖孔穴法检测了 4种抗菌肽对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的杀伤作用,结果表明,Scolopin-2及酰胺化Scolopin-2具有杀菌作用。增殖抑制实验(MTT)结果表明Scolopin-2及酰胺化Scolopin-2对肿瘤细胞的增殖抑制作用呈浓度依赖性,并且酰胺化Scolopin-2的作用效果明显强于Scolopin-2。所以,选取酰胺化Scolopin-2为对象进行抗肿瘤机制的研究。2.通过流式细胞仪检测了酰胺化Scolopin-2诱导肿瘤细胞凋亡的能力。结果显示,酰胺化增强了 Scolopin-2对宫颈癌细胞Hela、肝癌细胞HepG2以及白血病细胞K562凋亡的诱导能力;激光共聚焦实验发现酰胺化Scolopin-2能够与细胞中的线粒体结合,提示酰胺化Scolopin-2通过诱导细胞凋亡的方式杀伤肿瘤细胞,并提示其作用机制与线粒体通路相关。3.运用Western blot检测宫颈癌细胞Hela、肝癌细胞HepG2以及白血病细胞K562中凋亡相关蛋白caspase-3、Bax、Bcl-2和PARP的表达情况,结果显示,Scolopin-2及酰胺化Scolopin-2都能够引起肿瘤细胞内凋亡蛋白表达水平的改变,caspase-3、PARP和Bcl-2的表达量均有所下降,而Bax的表达量升高,并且呈现浓度依赖性,同时酰胺化Scolopin-2处理后的蛋白变化量明显比Scolopin-2处理后的变化量大。说明Scolopin-2及酰胺化Scolopin-2诱导细胞凋亡的机制与线粒体有关,并且酰胺化提高了抗菌肽诱导凋亡的能力。4.在体内水平,构建Hela宫颈癌裸鼠移植瘤模型,观察Scolopin-2-NH2治疗后裸鼠移植瘤及体内器官的生长情况,发现低剂量和高剂量Scolopin-2-NH2均有明显的抑瘤作用;组织切片的免疫化学染色结果显示Scolopin-2-NH2能够抑制肿瘤细胞的增殖和抑制血管生成来抑制肿瘤生长。综上所述,抗菌肽Scolopin-2的C末端酰胺化后诱导肿瘤细胞凋亡活性提高,其诱导肿瘤细胞凋亡与线粒体通路有关,并且对裸鼠宫颈癌移植瘤有明显的抑制作用。该研究结果为将抗菌肽应用于临床肿瘤的治疗方面提供了必要的实验基础和理论依据。