在现今的养禽业中,新城疫病毒(NDV, Newcastle Disease Virus)引起的新城疫(ND, Newcastle Disease)作为一种高传染性疾病,依然广泛地存在于世界各地。对其的防控手段主要以疫苗接种为主。随着现代分子生物学的发展,基因工程疫苗脱颖而出。其中重组NDV活载体疫苗以其稳定性、高滴度生长特性、免疫范围广、免疫手段多样性等等优势,成为最具发展潜力的疫苗。本研究以新选育纯化的、适应BHK-21细胞的耐热株TS09-C株为对象,利用反向遗传技术,拯救出重组新城疫病毒耐热株。重组病毒生物学特性结果表明,重组株保留了亲本株的耐热性、低致病力和高滴度生长特性。这意味着首个NDV耐热株的反向遗传操作系统的成功建立。在该系统建立的基础上,成功获得了插入有外源绿色荧光蛋白基因的重组耐热病毒。为之后插入其他病毒的免疫原性基因,多价苗的研制打下坚实的基础。同时也为耐热机理的研究创造平台。1.新城疫病毒TS09-C株反向遗传操作系统的建立在本实验室已成功构建TS09-C株全长cDNA的基础上,以全长质粒pBR-TS09-C为模板,扩增NP、P和L的全基因片段并分别克隆于质粒pVAX上,成功构建出3个辅助质粒pVAX-NP、pVAX-P、pVAX-L。以磷酸钙转染法将全长质粒pBR-TS09-C与辅助质粒pVAX-NP、pVAX-P、pVAX-L共转染至BHK-21细胞,转染细胞预孵育表达T7RNA聚合酶的痘病毒,收获培养物上清,分别接种BHK-21细胞、9日龄SPF鸡胚尿囊腔；培养3-5d,收获细胞上清、鸡胚尿囊液后,以Real-time PCR、HA、IFA、电镜、SDS-PAGE等方法进行检测,结果显示重组病毒拯救成功,同时标志着NDV耐热株反向遗传操作系统建立。2.重组新城疫病毒(rTS09-C)生物学特性的研究拯救出的重组新城疫病毒(rTS09-C)致病力检测包括ICPI、IVPI、MDT3个方面。其结果为：ICPI为0、IVPI为0、MDT值>150h。由此结果可得出rTS09-C株保留了TS09-C株弱毒低致病力的特性。对rTS09-C株的细胞、鸡胚增殖滴度和血凝效价进行测定,rTS09-C株的细胞增殖滴度为107TCID50/mL,鸡胚增殖滴度为107-5EID50/mL,血凝效价为27,均与亲本株相似。rTS09-C株的生长曲线测定结果表明rTS09-C无论在细胞水平上,还是在鸡胚水平上的生长曲线整体趋势均与TS09-C株相近,即rTS09-C株保留了TS09-C株的高滴度生长特性。对rTS09-C株的耐热性进行测试,与TS09-C株、Lasota株进行比较。结果显示,Lasota株56℃水浴作用9min后即失去血凝活性,而TS09-C株可耐热达75min,rTS09-C株56℃水浴作用150min仍保持血凝活性。在此基础上,对rTS09-C株与TS09-C株的耐热感染性进行检测,结果表明,rTS09-C株耐热120min后仍具有感染性,比TS09-C株耐热时间长60min。因此,rTS09-C株不仅保留了TS09-C株耐热的特性,而且耐热特性得到提升。rTS09-C株这一特性对于作为疫苗载体来说,是非常有利的条件。可使疫苗打破冷链的束缚,广泛地运用于实践中。3.表达绿色荧光蛋白重组新城疫病毒TS09-C疫苗株的构建在NDV TS09-C耐热株反向遗传操作系统成功建立的基础上,结合国内外对NDV载体改造的经验,选取NP基因上游以及P和M基因的间隔区这两个位点作为外源基因插入位点,选用便于观察、检测的GFP基因作为外源基因；尝试利用首个耐热株NDV反向遗传平台来拯救表达GFP基因的重组病毒。将构建成功的全长质粒pBR-GFP-TS09-C/Np、BR-GFP-TS09-C/M分别与3个辅助质粒共转染BHK-21细胞。收获病毒液后,分别接种BHK-21细胞和SPF鸡胚进行增殖。通过Real-time PCR、HA试验,荧光显微镜观察,结果表明rGFP-TS09-C/M拯救成功,而GFP插于NP上游的方案拯救失败。推测失败原因,可能是位于NP上游的GFP的表达影响了重组病毒粒子自身的组装合成。即得到P、M基因间隔区为较适宜的插入外源基因的位点。综上所述,本论文构建了首个NDV TS09-C耐热株反向遗传操作系统,得到了一株保留了亲本株弱毒低致病力、高滴度生长特性的重组新城疫病毒耐热株。该株不仅保留了亲本株耐热的特性,并且耐热感染性的时间延长至120min。利用建立的反向遗传操作平台,于P和M基因的间隔区插入GFP基因,成功得到可表达GFP的重组新城毒耐热株。为后续插入其他病毒的免疫原性基因以及多价苗的研制打下坚实的基础。同时也为耐热机理的研究创造了平台。