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背景和目的:胞浆钙超载和细胞核反应异常在心肌缺血再灌注损伤发生中处于中心地位,但是心肌缺血再灌注损伤时从细胞内钙超载到细胞核反应异常的共同信号转导通路尚未阐明。近年研究表明,细胞核具有相对独立的钙稳态调节系统,能对细胞核钙稳态和钙信号进行调节,而细胞核钙稳态和钙信号参与DNA复制、DNA修复、基因表达、核蛋白磷酸化、细胞增殖、分化及细胞凋亡等核反应过程的调节。本研究的目的旨在揭示缺血再灌注损伤时心肌细胞核游离钙浓度[Ca2+]n变化特征、核膜兰尼定受体(RyR)变化特征及磷酸化调节对该受体的影响,为阐明心肌缺血再灌注损伤的细胞核钙信号机制提供实验依据。材料与方法:健康雄性成年Wistar大鼠随机分为缺血再灌注损伤(IRI)组和假手术(Sham)组,结扎冠状动脉左支制备心肌缺血再灌注损伤模型;比色法测定心肌组织匀浆SOD活性、GSH含量,免疫组化染色检测心肌细胞c-Fos、Bcl-2及Bax表达,图象分析法测定心肌组织Bcl-2阳性细胞与Bax阳性细胞的平均吸光值(AA)的比值;蔗糖密度梯度超速离心法分离心肌细胞核,酶学方法鉴定分离的细胞核纯度;双波长荧光分光光度法测定分离的心肌细胞[Ca2+]n;3H-ryanodine饱和结合法分析心肌细胞核RyR的最大结合容量Bmax和解离常数Kd;观察添加PMA+PS激活内源性PKC和添加Ca2+-CaM后心肌细胞核RyR的最大结合容量Bmax和解离常数Kd的变化。结果:(1) IRI组心肌匀浆SOD活性较Sham组降低18.2%(P<0.05);GSH含量较Sham组降低15.8%(P<0.05)。(2)IRI组心肌组织c-Fos阳性表达细胞率显著高于Sham组(P<0.01);IRI组心肌组织中Bax表达明显增强(P<0.01);Bcl-2表达也有增强(P<0.05);但IRI组Bcl-2/Bax平均吸光值比值低于Sham组。(3)分离的心肌细胞核蛋白含量为匀浆的1/35-1/40,蛋白质与DNA含量比值为6 ～ 8,核回收率25%～35%;细胞核各亚细胞组分标志酶的活性均低于匀浆的5%。(4)在细胞核悬浮介质中存在10 mmol.L-1 ATP时,Sham组和IRI心肌[Ca2+]n均随悬浮介质中钙浓度增加而增加;当核外游离钙为0.1μmol.L-1时,两组心肌[Ca2+]n无明显差别(P>0.05);当核外游离钙为1μmol.L-1和10μmol.L-1时,IRI组[Ca2+]n明显高于Sham组(P<0.01)。(5)在细胞核悬浮液中无<WP=9>ATP和Ca2+时,IRI组和Sham组心肌[Ca2+]n无明显差别(P>0.05);核外游离钙在0.4～1.6μmol.L-1时两组心肌[Ca2+]n均较在不含钙缓冲液中增加;但Sham组心肌[Ca2+]n在此范围内相对稳定;而IRI组心肌[Ca2+]n在核外游离钙浓度为1.6μmol.L-1时则明显增加(P<0.05)。(6)大鼠心肌细胞核上存在少量3H-Ry特异性结合位点,即RyR,其Bmax值小于100pmol.gpro-1,但亲和力高,其Kd值为nmol.L-1级。(7)与Sham组相比,IRI组心肌细胞核RyR的最大结合容量Bmax值降低33%(P<0.01);而离解常数Kd无显著差异(P>0.05)。(8)Sham组和IRI组心肌细胞核经PMA+PS处理后,RyR的Bmax值分别较处理前增加了73%和95%,处理前后Bmax值增加非常显著(P<0.01)。Sham组和IRI组心肌细胞核经Ca2+-CaM处理后Bmax值分别降低39%和17%,处理前后Bmax值降低均显著(P<0.05),但IRI组Bmax值降低幅度相对于Sham组明显较小。2种处理方式对IRI组和Sham组心肌细胞核RyR的Kd值均无明显影响(P>0.05)。结论:(1)成功制备了大鼠在体心肌缺血再灌注损伤模型,模型能复制缺血再灌注损伤心肌细胞核反应的异常,也能复制缺血再灌注损伤心肌细胞氧化应激的增强;(2)采用蔗糖密度梯度超速离心法分离的心肌细胞核经酶学方法鉴定,纯度高,可以排除其他细胞组分的混杂;(3)无论心肌细胞核外有无ATP,细胞核悬浮介质中过高的游离钙浓度均可引起缺血再灌注损伤心肌细胞核游离钙浓度的急剧增加;(4)缺血再灌注损伤心肌细胞核3H-ryanodine最大结合容量降低;无论有无缺血再灌注损伤,PMA+PS处理后的心肌细胞核3H-ryanodine最大结合容量均显著增加,而Ca2+-CaM处理后的心肌细胞核3H-ryanodine最大结合容量均降低,而上述情况下3H-ryanodine与RyR解离常数无改变。