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太湖流域地方品种猪主要有:二花脸猪、梅山猪、枫泾猪、沙乌头猪、米猪、嘉兴黑猪,其中梅山猪因体型大小分为中梅山猪和小梅山猪。太湖流域地方品种猪同根共源,又各具特点,但因其体型外貌相近,尤其是仔猪,在生产中存在混淆的情况,而通过传统体型外貌品种鉴定方法将太湖流域地方品种猪各个品种进行区分难度较大,不利于有效地开展保种和开发利用工作。另一方面,太湖流域地方品种猪肉质鲜美而广受消费者欢迎,其经济价值高于市场常见的杜洛克、长白、大白猪等杂交后代猪肉,因而市场上出现了上述杂交后代猪肉假冒的太湖流域地方品种猪肉销售的情况,以及将上述杂交猪肉掺假在太湖流域地方品种猪肉产品(例如火腿、肉馅等)的销售行为,但传统方法无法对宰杀分割肉和处理后的肉制品进行准确归属判断。单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性,具有位点丰富、分布广泛、遗传稳定性高、具有代表性、检测便捷快速等特点。而其中,在一定的品种(群体)范围内,只在一个群体中出现的SNP被称作品种特异SNP。品种特异SNP位点筛选和位点组合方法研究是开展品种和制品鉴定的关键。因此本研究基于实验室已有的太湖流域地方品种猪和三个当前主流引进品种(杜洛克猪、长白猪、大白猪)简化基因组测序数据开展以下工作:一、用于品种及制品鉴定的SNP位点筛选分析:(1)基于七个太湖流域地方品种和三个引进品种共458个样本的简化基因组测序数据开展SNP位点筛选。首先利用NGSQC v2.3软件对原始的测序reads进行质控过滤,除去primer/adaptor污染的reads,得到18亿个有效Reads;然后利用SAMtools v0.1.19等软件进行SNP计算,并利用自编的perl语言计算品种特异SNP序列共得到16,080个品种特异SNP。(2)上述16,080个品种特异SNP以杜洛克参考基因组为对照,等位基因突变频率大于0.5的品种特异SNP位点有1887个,在各个品种均有分布。本研究按等位基因突变频率由高到低筛选出各个品种用于鉴定的的SNP位点(同一个品种避免同一条染色体上筛选两个及以上位点),十个品种共得到46个SNP位点作为下一步的品种与制品鉴别的候选位点。二、品种与制品最优鉴定方法研究制定:(1)单品种鉴定:以太湖流域小梅山猪为例研究制定最优鉴定方法,基于上一步筛选出的46个特异SNP位点中的5个小梅山猪品种特异SNP位点(chr7:91759815等),设计了单一位点、两位点组合、三位点组合和四位点组分别作为一个鉴定筛选标记,共计4种鉴定方法。基于鉴定概率(PI)和杂合子鉴定假阳性错判概率(PM)筛选最优鉴定组合。结果显示,以三个SNP位点组合的方法鉴定效力最高,PI值达到0.99,同时PM值仅为0.002。(2)制品鉴定:基于上一步单品种鉴定筛选出的三个SNP位点组合的鉴定方法,按品种进行组合,共得到74个鉴定组合用于十个品种制品的鉴定,并计算了各个品种的鉴定概率和假阳性错判概率。该制品鉴定组合在各个品种的PI值均大于0.99。且除沙乌头猪外,其它9个品种采用组合鉴定法的假阳性错判概率均低于0.05。三、鉴定方法独立核实验证:(1)单品种鉴定:选取20头小梅山猪样本,其他品种每个品种选取10个样本,增加皮特兰猪、巴克夏猪,金华猪作为干扰群体每个品种选取10个样本(所有样本独立选取,非用于上述第一步筛选SNP测序样本),一共140个样本进行Sanger测序。通过计算鉴定准确率(AI)和判断假阳性错判情况对单品种鉴定的四种不同的鉴定方法进行评估。独立核实验证结果显示,三个SNP位点作为一组鉴定标记的方法是最优方法,鉴定准确率为100%,且无假阳性错判情况。(2)制品鉴定:本实验利用十个鉴定品种的耳组织样本模拟制品进行研究。本实验十个品种中每个品种选取10个耳组织样本,并加入干扰群体皮特兰猪、巴克夏猪样本各10个,以及杜洛克长白杂交品种样本5个,长白大白杂交品种样本5个,共130个样本采用SNa Pshot法进行测序。通过计算鉴定准确率(AI)和假阳性错判率(FPR),采用三个SNP位点作为标记法鉴定是上述哪个品种的肉制品准确率可以达到98%,假阳性错判率最高仅为2.5%(二花脸猪),同时该方法能够对杂交品种进行鉴定。本项研究筛选出最优的太湖流地方品种猪及制品鉴定的体系,该鉴定体系为太湖流域地方品种猪遗传资源保护提供品种鉴定技术支持,同时也为打击假冒太湖流域地方品种猪肉制品提供技术支持,对太湖流域地方品种猪的遗传资源保护和经济价值保护具有重要意义。